1,、使用賽多培®噬菌體抑制劑與現(xiàn)有噬菌體防治手段相比有哪些優(yōu)勢(shì),？

在生物醫(yī)藥（抗生素、疫苗,、蛋白藥物,、基因治療載體）、工業(yè)酶制劑,、生物反應(yīng)器工藝研究等依賴大規(guī)模細(xì)菌培養(yǎng)的領(lǐng)域,，傳統(tǒng)防治噬菌體的方法（如設(shè)備消毒、菌種輪換）成本高且無法預(yù)防噬菌體污染,，如果一旦發(fā)生噬菌體污染,，會(huì)導(dǎo)致批次發(fā)酵失敗，造成大量物料損失和人工成本的浪費(fèi),。傳統(tǒng)噬菌體消殺步驟繁瑣,，且需要耗費(fèi)大量時(shí)間，影響研發(fā)和生產(chǎn)進(jìn)度,。

賽多培®噬菌體抑制劑可以作為細(xì)菌培養(yǎng)的保護(hù)劑使用,，盡最大可能保證發(fā)酵成功率，避免物料損失,，同時(shí)減輕了環(huán)境消殺等成本,。抑制劑作為直接添加的解決方案更便捷。

2,、噬菌體抑制劑抑制噬菌體的原理是什么,？抑制劑的添加會(huì)影響菌的生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)水平嗎？

賽多培®噬菌體抑制劑主要抑制噬菌體的生長(zhǎng)繁殖,。根據(jù)我們實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,，進(jìn)行大腸桿菌培養(yǎng)時(shí)，用富營養(yǎng)培養(yǎng)基例如TB培養(yǎng)基,、2YT培養(yǎng)基,、賽多培®增強(qiáng)型LB預(yù)混培養(yǎng)基、賽多培®大腸桿菌高密度表達(dá)培養(yǎng)基等,，抑制劑的添加不會(huì)影響菌的正常生長(zhǎng),。若使用普通LB培養(yǎng)基，因?yàn)闋I養(yǎng)不充分,，噬菌體抑制劑的添加對(duì)菌的生長(zhǎng)有抑制作用,，可以嘗試用如下方案減小噬菌體抑制劑對(duì)菌的抑制作用：①延長(zhǎng)細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間2-4h；②根據(jù)環(huán)境爆發(fā)的劇烈程度,，嘗試減量使用,；③通過增加溶氧的方式提高菌的生長(zhǎng)速度,；④若使用搖瓶培養(yǎng)，建議抑制劑在OD₆₀₀在0.8-1之間的時(shí)候添加噬菌體抑制劑,，若使用發(fā)酵罐培養(yǎng),，菌生長(zhǎng)到OD₆₀₀ 1-2左右再添加抑制劑，上述四種方案可以根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需求組合使用,。

噬菌體抑制劑的添加對(duì)蛋白的正常表達(dá)不會(huì)產(chǎn)生影響,。

3、說明書中,，噬菌體抑制劑的用量是一個(gè)范圍值,，在使用時(shí)究竟按照什么比例添加？

通常情況下,，每升培養(yǎng)基添加2毫升抑制劑液體（1000:2）即可顯著發(fā)揮抗噬菌體效果,，保障菌體正常生長(zhǎng)。
在噬菌體污染嚴(yán)重的環(huán)境中,，或使用發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵時(shí),，為保證噬菌體抑制效果，每升培養(yǎng)基可添加6毫升抑制劑液體（1000:6）,。

抑制劑在富營養(yǎng)的培養(yǎng)基中,，最高可以加到10ml，LB培養(yǎng)基中可以最高加到6ml,。建議2ml考慮的是使用成本問題以及菌體生長(zhǎng)速率問題,。我們的建議用量主要考慮使用成本、菌體生長(zhǎng)速率以及噬菌體污染情況確定的,。如果環(huán)境中噬菌體處于高爆發(fā)期間,，建議增加用量。

4,、加噬菌體抑制劑一點(diǎn)效果都沒有,，什么原因？

添加噬菌體抑制劑沒有效果的原因有多種,，經(jīng)過我們與客戶溝通,，常見有如下原因：①搖瓶培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)過夜菌不長(zhǎng)，大概率是菌種活性問題,，同時(shí)也需要觀察是否存在培養(yǎng)條件失控,、裝液量過大的情況；②環(huán)境中噬菌體爆發(fā)期,，建議通過小型梯度實(shí)驗(yàn),，摸索合適用量；③實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部除了噬菌體之外，可能存在真菌,、曲霉、金黃色葡萄球菌等雜菌污染,，這就需要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理,、執(zhí)行嚴(yán)格的無菌操作規(guī)范，以避免雜菌污染帶來的影響,。

為此,，我們根據(jù)實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)，可以通過下面方法對(duì)培養(yǎng)體系的污染情況進(jìn)行判斷：

如果只有細(xì)胞碎片,，大概率是噬菌體污染,；
如果OD₆₀₀值在1以下時(shí)菌出現(xiàn)死亡（菌體生長(zhǎng)1-3小時(shí)，誘導(dǎo)前）,，則考慮感染烈性噬菌體,；
如果OD₆₀₀值在1到2之間，誘導(dǎo)之后逐漸開始死亡（有些1-3小時(shí),，有些5小時(shí)左右）,，則考慮溫和噬菌體污染；
如果同時(shí)伴有白色絮狀物,，或粘性的,，或拉絲狀的，或蘑菇狀的,，或有聚集狀白色的,，則考慮伴隨雜菌污染。

5,、添加抑制劑后,，細(xì)菌在發(fā)酵罐中前期不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢？

出現(xiàn)OD₆₀₀值到2-3后,，不再增長(zhǎng)時(shí),，請(qǐng)仔細(xì)檢查發(fā)酵罐罐壓是否穩(wěn)定，建議增加通氣量,。

如果生長(zhǎng)緩慢,，那么建議抑制劑在OD₆₀₀ 1-2左右時(shí)進(jìn)行添加。

環(huán)境惡劣的情況下,，在誘導(dǎo)時(shí)進(jìn)行抑制劑補(bǔ)加,，具體用量視環(huán)境污染程度而定。

6,、用發(fā)酵罐發(fā)酵時(shí),，添加了抑制劑，前期比較正常，但后期出現(xiàn)菌體死亡,，這是什么原因,？

出現(xiàn)這種情況，主要應(yīng)對(duì)發(fā)酵操作過程進(jìn)行排查,。以下原因往往會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵后期菌體死亡：

① 營養(yǎng)物質(zhì)耗盡,。發(fā)酵后期，碳源（如葡萄糖）,、氮源（如銨鹽）或其他關(guān)鍵營養(yǎng)（如磷酸鹽,、微量元素）可能耗盡，導(dǎo)致細(xì)菌無法維持代謝活動(dòng),。主要表現(xiàn)為溶氧突然上升（細(xì)菌停止耗氧）,、pH異常波動(dòng)（代謝活動(dòng)停滯）。
② 代謝產(chǎn)物積累,。細(xì)菌代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物（如乳酸,、乙酸、乙醇,、氨,、CO?等）可能達(dá)到毒性濃度，抑制生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致死亡,。
③ 溶解氧（DO）不足或過量,。
好氧菌：后期菌體密度高，需氧量大為增加,，若供氧不足（攪拌或通氣不足）,，會(huì)導(dǎo)致缺氧死亡。兼性厭氧菌：過量溶氧可能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)（如自由基積累）,。
④ pH失控,。代謝產(chǎn)物（如有機(jī)酸、堿）導(dǎo)致pH超出菌種耐受范圍,，影響酶活性和細(xì)胞膜穩(wěn)定性,。
⑤ 溫度波動(dòng)。發(fā)酵后期代謝產(chǎn)熱增加,，若冷卻系統(tǒng)失效,，溫度升高可能引起蛋白質(zhì)變性或代謝紊亂。
⑥ 菌種自身問題,。質(zhì)粒丟失,、基因突變或代謝途徑異常（如過度表達(dá)外源蛋白導(dǎo)致“代謝負(fù)擔(dān)”）。
⑦ 雜菌或噬菌體污染,。雜菌競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)或分泌毒素,。如果添加了噬菌體抑制劑,，一般不會(huì)在后期出現(xiàn)噬菌體感染導(dǎo)致細(xì)菌裂解情況，但也存在因通氣帶來噬菌體持續(xù)性輸入,，影響抑制劑效果,，建議補(bǔ)加噬菌體抑制劑。

7,、抑制劑是否再次滅菌,？該如何添加？

賽多培®噬菌體抑制劑生產(chǎn)過程中,，會(huì)進(jìn)行0.22μm過濾除菌和高溫滅菌處理,，無需再次滅菌,?？梢园凑照f明書指導(dǎo)比例或?qū)嶋H需要的比例，直接加入到搖瓶或發(fā)酵罐的培養(yǎng)基（滅菌后）中,，添加方式與抗生素相同,。

8、噬菌體抑制劑大量使用一段時(shí)間后是否會(huì)產(chǎn)生抗藥性呢,？

不會(huì)產(chǎn)生任何抗藥性,，請(qǐng)放心使用。