Tuner(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
產(chǎn)品信息：
組成 BC211-01 BC211-02
Tuner(DE3) 10×100?l 20×100?l
pUC19 質(zhì)粒 5?l 5?l
儲(chǔ)存條件：-70℃保存，避免反復(fù)凍融,。不適合在液氮中保存,。
產(chǎn)品介紹：
Tuner(DE3)為 LacYZ 突變型 BL21(DE3)菌株。Tuner(DE3)菌株可利用 IPTG 的加入量來精準(zhǔn)地控制重組蛋白的表達(dá)量,，與 pET
系列載體聯(lián)合使用,，可以使得蛋白表達(dá)從低表達(dá)水平到高表達(dá)水平進(jìn)行有效調(diào)控（使用低濃度的 IPTG 誘導(dǎo)重組蛋白低水平表達(dá)時(shí)，
目的蛋白可能會(huì)具有更好的可溶性和生物活性）,。該菌株含有λ噬菌體 DE3 區(qū),，可以表達(dá) T7 RNA 聚合酶。Tuner(DE3)菌株屬于 B
菌株,，lon 和 ompT 蛋白酶缺陷型,。Tuner(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制成，pUC19 質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率達(dá) 10 7cfu/μg DNA,。
基因型：F -ompT hsdSB (rB -mB -) gal dcmlacY1 (DE3)
菌株抗性：對氨芐,，，和四環(huán)素敏感,。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟：（以氨芐抗性的 pET 質(zhì)粒為例）
1. 將感受態(tài)細(xì)胞置于冰水浴中化凍,。待細(xì)胞剛化凍后，加入 1-5μl 含有 1-100ng 的質(zhì)粒 DNA 到細(xì)胞中,，用手指管底,，輕
輕混勻。
2. 冰水浴中放置 30 分鐘,，不要晃動(dòng),。
3. 42℃熱擊 60 秒鐘，不要晃動(dòng),。
4. 冰水浴中放置 2 分鐘,，不要晃動(dòng)。
5. 加入 500μl 的室溫的 SOC 或 LB 培養(yǎng)基,。
6. 置于 37℃搖床中,，150-200rpm，復(fù)蘇培養(yǎng) 60 分鐘,。
7. 取 50-100μl 菌液涂布在含有氨芐抗性的 LB 平板上,。待液體吸干后，倒置平板 37℃培養(yǎng) 12-24 小時(shí),。
（平板劃線分離法：復(fù)蘇培養(yǎng)結(jié)束后,，12000rpm 離心 30 秒鐘，棄掉上清,，留 100μl 左右的液體,，用 200μl 吸頭輕輕吹打散菌塊，
取 10μl 重懸的菌液分多點(diǎn)滴在平板上,，傾斜吸頭,，用吸頭頭部的側(cè)面將滴在平板上的液體來回劃線。這個(gè)方法可以獲得更大的
單克隆菌落）。
蛋白表達(dá)步驟：
1. 挑取單菌落,，接種到含 5ml 帶抗生素的 LB 培養(yǎng)基中,。
2. 37℃，200rpm 震蕩培養(yǎng)細(xì)菌至對數(shù)生長期（OD600=0.4-0.8）,。
3. 加入 IPTG 到終濃度為 0.4mM,，37℃誘導(dǎo) 4 小時(shí)或 16℃誘導(dǎo)過夜。（可以設(shè)定不同濃度的 IPTG 來誘導(dǎo)表達(dá)）
4. 誘導(dǎo)完成后,，離心收集菌體,，用合適的方法（如考馬斯亮藍(lán)染膠法，Western-Blot法或酶活性分析法）分析菌體裂解物的總
蛋白,、上清和沉淀組分,，明確表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)狀況（可溶性或不溶性表達(dá)）。
5. 重組蛋白大量表達(dá)時(shí),，可用 10ml 過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到 1L 培養(yǎng)基中,，當(dāng)培養(yǎng)到 OD600=0.4-0.8 時(shí)，加入終濃度為 0.4mM 的 IPTG,，
37℃誘導(dǎo) 4 小時(shí)或 16℃誘導(dǎo)過夜（不同蛋白表達(dá)的條件有所不同,，需在實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化）。