AGL1農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞

產(chǎn)品信息：

組成 BC302-01
AGL1 Chemically Competent Cell 20×100μl
pCAMBIA2301（100ng/μl） 1 支

儲存條件：-70℃保存，避免反復凍融,。
基因型：
C58RecA (rif R /carb R ) Ti pTiBo542DT-DNA (strep R ) Succinamopine
產(chǎn)品介紹：
AGL1 菌株為 C58, RecA 型背景,，核基因中含有篩選標簽——抗性基因 Rif 和羧芐抗性基因
carb，為了便于轉(zhuǎn)化操作,，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的琥珀堿型 Ti 質(zhì)粒 pTiBo542DT-DNA,，此質(zhì)粒含有
vir 基因（vir 基因是 T-DNA 插入植物基因組必需的元件， pTiBo542DT-DNA 質(zhì)粒自身的 T-DNA 轉(zhuǎn)移功能被
破壞,，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體 T-DNA 順利轉(zhuǎn)移）,。pTiBo542DT-DNA 型 Ti 質(zhì)粒含有篩選標簽：Strep，賦
予 AGL1 菌株抗性,，適用于水稻,、擬南芥、楊樹等植物的轉(zhuǎn)基因操作,，經(jīng)植物雙元 pCAMBIA2301 表達
質(zhì)粒檢測,，轉(zhuǎn)化效率可達 10 3 cfu/μg，-70℃保存 12 個月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變,。
轉(zhuǎn)化方法
（采用凍融方法）
1. 取-70℃保存的 AGL1 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞于冰水浴中融化,；
2. 無菌條件下，向感受態(tài)細胞中加入 100ng-1μg 質(zhì)粒 DNA（次使用前做預實驗確定所加質(zhì)粒的
量）,，輕輕混勻,，冰水浴中靜置 5 分鐘；
3. 將離心管置于液氮中速凍 5 分鐘,；（注：也可以用干冰和無水乙醇混合物代替液氮）
4. 然后快速將離心管置于 37℃水浴中保持 5 分鐘,，不要晃動水面；
5. 將離心管放回冰水浴中,，冰浴 5 分鐘,；
6. 無菌條件下加入 800μl 無抗生素的 2xYT 或 LB 液體培養(yǎng)基，于 28℃振蕩培養(yǎng) 2-3 小時,，菌體復蘇,；
7. 6000rpm 離心 1 分鐘收菌，留 100μl 左右上清,，輕輕吹打重懸菌體,，取適量菌液，涂布于相應抗生素的
LB 平板上,，于 28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 48-72 小時,。
（當平板只含有 50 μg/ml Kan 時，28℃培養(yǎng) 48 h 即可,；平板中同時加入 50 μg/ml Kan,，20 μg/ml Rif 時，需 28℃
培養(yǎng) 60 h,；如果使用的平板含有 50 μg/ml Rif 則需要 28℃培養(yǎng) 72-90 h）,。
注意事項
1. 加入質(zhì)粒時體積不應大于感受態(tài)體積的 1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染,，轉(zhuǎn)化效率急劇下降,；
質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級,。
2. 混入質(zhì)粒時應輕柔操作,。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應減少最終用于涂板的菌量,。
3. 平板上陽性克隆密度過大時,，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢,，菌落變小,，為了獲得大的菌落，應
減少質(zhì)粒用量,。
4. 濃度不應高于 25 μg/ml,，過高的濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率,。
5. 培養(yǎng)基中加入的目的是防止雜菌生長,、篩選農(nóng)桿菌,；根據(jù)所用菌株抗性加入 Ti 質(zhì)粒篩選抗生素
可防止 Ti 質(zhì)粒丟失，但 Ti 質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作,，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮
這些抗生素,，Ti 質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)


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