EHA105 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品信息：

組成 BC303-01
EHA105 Chemically Competent Cell 20×100μl
pCAMBIA2301（100ng/μl） 1 支
儲存條件：-70℃保存,，避免反復(fù)凍融。
基因型：
C58 (rif R ) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) (strep R ) Succinamopine
產(chǎn)品介紹：
EHA105 菌株由 EHA101 菌株改造而來,，為 C58 型背景,，核基因中含有篩選標(biāo)簽——抗性基因 Rif，
為了便于轉(zhuǎn)化操作,，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的琥珀堿型 Ti 質(zhì)粒 pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) ,，此質(zhì)粒
含有 vir 基因（vir 基因是 T-DNA 插入植物基因組必需的元件，pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的
T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞,，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體 T-DNA 順利轉(zhuǎn)移）,。pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)
Ti 質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：Strep，賦予 EHA105 菌株抗性,，適用于水稻,、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作經(jīng)植物
雙元pCAMBIA2301 質(zhì)粒檢測，轉(zhuǎn)化效率可達(dá) 10 3 cfu/μg,，-70℃保存 12 個月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變,。
轉(zhuǎn)化方法（采用凍融方法）
1. 取-70℃保存的 EHA105 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞于冰水浴中融化；
2. 無菌條件下,，向感受態(tài)細(xì)胞中加入 100ng-1μg 質(zhì)粒 DNA（次使用前做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的
量）,，輕輕混勻，冰水浴中靜置 5 分鐘,；
3. 將離心管置于液氮中速凍 5 分鐘,；（注：也可以用干冰和無水乙醇混合物代替液氮）
4. 然后快速將離心管置于 37℃水浴中保持 5 分鐘，不要晃動水面,；
5. 將離心管放回冰水浴中,，冰浴 5 分鐘,；
6. 無菌條件下加入 800μl 無抗生素的 2xYT 或 LB 液體培養(yǎng)基，于 28℃振蕩培養(yǎng) 2-3 小時(shí),，菌體復(fù)蘇,；
7. 6000rpm 離心 1 分鐘收菌，留 100μl 左右上清,，輕輕吹打重懸菌體,，取適量菌液，涂布于相應(yīng)抗生素的
LB 平板上,，于 28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 48-72 小時(shí),。
（當(dāng)平板只含有 50 μg/ml Kan 時(shí)，28℃培養(yǎng) 48 h 即可,；平板中同時(shí)加入 50 μg/ml Kan,，20 μg/ml Rif 時(shí)，需 28℃
培養(yǎng) 60 h,；如果使用的平板含有 50 μg/ml Rif 則需要 28℃培養(yǎng) 72-90 h）,。
注意事項(xiàng)
1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的 1/10；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染,，轉(zhuǎn)化效率急劇下降,；
質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級,。
2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作,。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量,。
3. 平板上陽性克隆密度過大時(shí),，由于營養(yǎng)不足，陽性克隆生長變慢,，菌落變小,，為了獲得大的菌落，應(yīng)
減少質(zhì)粒用量,。
4. 濃度不應(yīng)高于 25 μg/ml,，過高的濃度不利于農(nóng)桿菌生長，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率,。
5. 培養(yǎng)基中加入的目的是防止雜菌生長,、篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入 Ti 質(zhì)粒篩選抗生素
可防止 Ti 質(zhì)粒丟失,，但 Ti 質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作,，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮
這些抗生素，Ti 質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略),。


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抗體：兔多抗、鼠單抗種類豐富,，一抗 1 萬余種,，二抗 100 多種；
重組蛋白：多項(xiàng)發(fā)明,，原核表達(dá)系統(tǒng)穩(wěn)定表達(dá)蛋白 1000 余種,。


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