EHA105 農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品組成：

組成 BC307-01
EHA105 Electrocompetent cells 20×50μl
pCAMBIA2301 (10ng/μl) 1 支
儲(chǔ)存條件：-70℃保存，避免反復(fù)凍融,。
基因型：C58 (RifR ) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) (StrR ), Succinamopine type
產(chǎn)品說明：
EHA105由EHA101菌株改造而來(Hood et al., 1993),，為農(nóng)桿菌C58型背景，核基因中含有抗性基因
(Rif),。此菌株還攜帶一種自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能喪失的質(zhì)粒(disarmed Ti plasmid),。EHA105菌株含有胭脂堿型Ti質(zhì)粒
pEHA105 (pTiBo542DT-DNA),該質(zhì)粒含有vir基因(vir基因是TDNA插入植物基因組所必需的元件，pEHA105
(pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞,，但可輔助植物雙元表達(dá)載體的T-DNA的轉(zhuǎn)移）,。
pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒還含有Str抗性基因，賦予EHA105菌株抗性,。EHA105農(nóng)桿菌適用于水
稻,、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。EHA105電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化,，經(jīng)pCAMBIA2301質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化
效率大于10 5 cfu/μg DNA,。
操作方法：
1. 電極間距為0.1cm的電轉(zhuǎn)杯（Gene Pulser®/MicroPulser™ electroporation cuvettes）插入碎冰中，壓實(shí)冰
面,，冰中靜置5分鐘,，使電轉(zhuǎn)杯充分降溫。（電轉(zhuǎn)杯重復(fù)使用方法：每次用完后,，用大量的自來水沖洗
干凈去掉菌液和DNA，用蒸餾水洗3遍,，將其泡在75%乙醇中30分鐘,，取出杯子，瀝干液體,，放在超凈
臺(tái)中,，使乙醇充分揮發(fā)，蓋上蓋子放干燥地方備用,。）
2. 取-70℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘,，待其融化，加入10ng-1μg質(zhì)粒DNA（洗脫或溶解質(zhì)粒的
溶液中離子不能太高,，可用雙蒸水稀釋,。次使用前做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量），用手
管底混勻,，立即插入冰中,，在超凈臺(tái)中用無菌吸頭將感受態(tài)-質(zhì)粒混合物快速移到電擊杯中,，蓋上
杯蓋,，空管保留待用,。
3. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置電擊參數(shù)：C=25μF,，PC=200ohm,，V=2.4KV（此參數(shù)為BioRad公司推薦，依據(jù)不同
電轉(zhuǎn)儀設(shè)置針對(duì)農(nóng)桿菌合適的電擊參數(shù)）,。用紙巾擦掉電轉(zhuǎn)杯外部的水分,，將電轉(zhuǎn)杯快速放入電轉(zhuǎn)槽
中進(jìn)行電擊步驟。電擊完成后,，將電轉(zhuǎn)杯快速插入冰中,，加入700μl無抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到原來保留的
感受態(tài)空管中，28℃,，150-200 rpm,，振蕩培養(yǎng)2-3小時(shí)。
4. 6000rpm離心一分鐘收菌,，留取200μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊,，取100μl的菌液涂布于含相應(yīng)抗生素
的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天（當(dāng)平板只含有50μg/ml Kan時(shí),，28℃培養(yǎng)48小時(shí)即
可,；平板中同時(shí)加入50μg/ml Kan，20μg/ml Rif時(shí),，需28℃培養(yǎng)60小時(shí),；如果使用的平板含有50μg/ml Rif
則需要28℃培養(yǎng)72-90小時(shí)）。
注意事項(xiàng)：
1. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作,，加入質(zhì)粒的體積不大于感受態(tài)體積的1/10,，質(zhì)粒不純或超大質(zhì)粒會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效
率急劇下降。
2. 平板上菌落過多時(shí),，菌落很小,。為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量或減少涂布量,，或?qū)⒕滢D(zhuǎn)移到
新平板上生長(zhǎng),。
3. 使用的工作濃度濃度不應(yīng)高于25 μg/ml，過高的濃度會(huì)降低生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率,。
4. 具有防止雜菌生長(zhǎng)篩選農(nóng)桿菌的作用,；根據(jù)所用菌株抗性加入或可防止Ti 質(zhì)
粒丟失，但不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作,，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)可不考慮添加或,，
Ti質(zhì)粒丟失的概率極低 (可忽略)。
Hood EE, Gelvin SB, Melchers S, Hoekema A (1993) New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to
plants (EHA105). Trans Res 2:208-218



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