DH10Bac 大腸桿菌克隆感受態(tài)細胞
產(chǎn)品信息：
組成 BC112-01
DH10Bac Competent cells 20×100μl
pUC19（0.1ng/μl） 5μl
儲存條件：-70℃保存,，避免反復(fù)凍融,。
產(chǎn)品介紹：
大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細胞，適用于昆蟲桿狀病毒Bac-to-Bac系統(tǒng)中同源重組的菌株,，用于產(chǎn)生重組
Bacmid,。是經(jīng)特殊工藝制備,，使用pUC19質(zhì)粒檢測，轉(zhuǎn)化效率可達107 cfu/μg,，-70℃保存幾個月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)
生改變,。
基因型：
F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80lacZΔM15ΔlacX74recA1endA1araD139Δ(ara,leu)7697galUgalKλ-rpsLnupG
/pMON14272/pMON7124
產(chǎn)品特點：
DH10Bac 細胞包含親本 Bacmid bMON14272 和輔助質(zhì)粒 pMON7124 親本 Bacmid 包含一個 mini-F 復(fù)制子、
抗性基因,、att Tn7 位點和 lac Zα-互補因子,。輔助質(zhì)粒包含 tns ABCD 區(qū)域，該區(qū)域提供了 mini-Tn7
從供體質(zhì)粒插入親本 Bacmid 靶位點所需要的轉(zhuǎn)座蛋白,。供體如 pFastBac 系列質(zhì)粒（pFastBac1,，pFastBacDual
等）含有 Tn7R 和 Tn7L 同源重組臂，Tn7R 和 Tn7L 之間包含抗性基因,、昆蟲病毒多角體基因啟動子,、
多克隆位點和 SV40 病毒的 PolyA 加尾信號。當(dāng)含有靶基因 pFastBac 的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 DH10Bac 細胞后,，發(fā)
生重組后就可產(chǎn)生重組 Bacmid,，提取純化重組 Bacmid 轉(zhuǎn)染昆蟲細胞 Sf9 或 Sf21 就可以包裝產(chǎn)生昆蟲病毒。
此外,，DH10Bac細胞中的The φ80dlacZΔM15基因的產(chǎn)物可以實現(xiàn)β-半乳糖苷酶的α-互補現(xiàn)象,，用于重組Bacmid
的藍白斑篩選。
操作步驟（以下操作均按無菌條件的標準進行）：
提示
?
感受態(tài)細胞應(yīng)保存在-70℃,，不可多次凍融和放置時間過長,，以避免降低感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率。
?
制備含下面抗生素的 LB 固體平板：
50μg/ml kanamycin,、7μg/ml gentamicin,、10μg/ml tetracycline、100μg/ml X-gal,、40μg/ml IPTG,。
1. 取感受態(tài)細胞置于冰浴中，如需分裝可將剛?cè)诨毎麘乙悍盅b到無菌預(yù)冷的離心管中,，置于冰浴
中,。（一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的建議用量為 50-100μl，可以根據(jù)實際情況分裝使用,。應(yīng)注意所用 DNA
體積不要超過感受態(tài)細胞懸液體積的十分之一,。)以下實驗以 100μl 感受態(tài)細胞為例。
2. 向感受態(tài)細胞懸液中加入 1-10ng 重組質(zhì)粒,，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物,，在冰浴中靜置 30 分鐘。
3. 將離心管置于 42℃水浴中放置 90 秒，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,，使細胞冷卻 2 分鐘,，該過程不要搖
動離心管。
4. 向每個離心管中加入 900μl 無菌的 SOC（不含抗生素）,，混勻后置于 37℃ ,200rpm,，搖床振蕩培養(yǎng) 4
小時。
5. 用 SOC 培養(yǎng)基進行 10 倍梯度稀釋,，如分成 3 個稀釋梯度 10-1,，10-2，10-3,。
6. 取 100ul 的各個梯度的培養(yǎng)物用于涂布,。等平板中的液體吸收后，倒置平板,，37℃培養(yǎng) 24-48 小時。
7. 保留剩余的菌液于 4℃冰箱中,，視平板上菌落生長情況決定去留,。
相關(guān)試劑及培養(yǎng)基的制備方法：
1. LB 液體培養(yǎng)基：稱取 10g Tryptone，5g Yeast Extract 和 10g NaCl 置于 1L 燒杯中,。加入約 800ml 的
去離子水,，溶解后用 2mol/L 的 NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH 值至 7.0。加去離子水定容至 1L,。分裝
后,，121℃高壓滅菌 20 分鐘。
2. SOB和SOC 培養(yǎng)基：稱取 20g Tryptone,，5g Yeast Extract,，0.5g NaCl 置于 1L 燒杯中加入約 800ml 的去
離子水，溶解后再補加 10ml 250mM KCl 溶液,，滴加 5M NaOH（約 0.2ml）調(diào) pH 至 7.0,。加入
去離子水將培養(yǎng)基定容至 1L。121℃滅菌 20 分鐘,。使用時加入5ml 滅菌的 2M MgCl2溶液（此種培養(yǎng)
基稱為 SOB）,。再補加經(jīng) 0.22μm 過濾除菌的 1M 葡萄糖溶液2ml（此種培養(yǎng)基為 SOC）。
3. 轉(zhuǎn)化復(fù)蘇細菌用的液體 LB 培養(yǎng)基或 SOC 培養(yǎng)基：可以一次高壓 50ml 液體培養(yǎng)基,，無菌狀態(tài)按 1ml
每管分裝于高壓滅菌的 1.5ml 離心管中,，裝于自封袋中，凍存于-20℃中,，每次用一支,。可以極大地避
免培養(yǎng)基污染和減少勞動量,。
4. LB 固體選擇培養(yǎng)基：100ml LB 液體培養(yǎng)基中加入 1.5g 瓊脂粉,，搖勻后,，121℃高壓滅菌 20 分鐘。
冷卻至 50℃左右時加入相應(yīng)濃度的抗生素（如 AMP 濃度通常為100μg/ml）,，混勻后倒在細菌用的無菌
培養(yǎng)皿中,，等瓊脂凝固后即可使用。
5. IPTG：稱量 1.9g IPTG（MW=238.31）充分溶解于 40ml 滅菌水,，濃度為200mmol/L,。用無菌0.22μm
過濾膜過濾除菌。小份分裝后,，-20℃保存,。
6. X-gal：用 DMF（二甲基甲酰胺）配制成 20mg/ml，小份分裝（1ml/份）后,，-20℃避光保存,。


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重組蛋白：多項發(fā)明，原核表達系統(tǒng)穩(wěn)定表達蛋白 1000 余種,。


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