LBA4404 農(nóng)桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品組成：

組成 BC305-01
LBA4404 Electrocompetent cells 20×50μl
pCAMBIA2301 ( 10ng/μl) 1 支
儲存條件：-70℃保存,，避免反復(fù)凍融。
基因型：Ach5 (Rif R ) Ti pAL4404 (StrR ), Octopine type
產(chǎn)品說明：
LBA4404菌株為農(nóng)桿菌Ach5型背景(Hoekema et al., 1983),，核基因中含有抗性基因(Rif),。此菌株還攜
帶一種自身轉(zhuǎn)運功能喪失的質(zhì)粒(disarmed Ti plasmid)，LBA4404菌株含有章魚堿型Ti質(zhì)粒pAL4404,，該質(zhì)粒含
有vir基因（
vir基因是TDNA插入植物基因組所必需的元件,，pAL4404質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可
輔助植物雙元表達(dá)載體的T-DNA的轉(zhuǎn)移）,。pAL4404質(zhì)粒含有抗性(Str),，賦予LBA4404菌株抗性。
LBA4404農(nóng)桿菌適用于番茄,、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作,。LBA4404電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，經(jīng)
pCAMBIA2301質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率大于10 5 cfu/μg DNA,。
操作方法：
1. 電極間距為0.1cm的電轉(zhuǎn)杯（Gene Pulser®/MicroPulser™ electroporation cuvettes）插入碎冰中，壓實冰
面,，冰中靜置5分鐘,，使電轉(zhuǎn)杯充分降溫。（電轉(zhuǎn)杯重復(fù)使用方法：每次用完后,，用大量的自來水沖洗
干凈去掉菌液和DNA,，用蒸餾水洗3遍，將其泡在75%乙醇中30分鐘,，取出杯子,，瀝干液體，放在超凈
臺中,，使乙醇充分揮發(fā),，蓋上蓋子放干燥地方備用）
2. 取-70℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘,，待其融化，加入10ng-1μg質(zhì)粒DNA（洗脫或溶解質(zhì)粒的
溶液中離子不能太高,，可用雙蒸水稀釋：次使用前做預(yù)實驗確定所加質(zhì)粒的量）,，用手
管底混勻，立即插入冰中,，在超凈臺中用無菌吸頭將感受態(tài)-質(zhì)?；旌衔锟焖僖频诫姄舯校w上
杯蓋,，空管保留待用,。
3. 啟動電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置電擊參數(shù)：C=25μF,，PC=200ohm,，V=2.4KV（此參數(shù)為BioRad公司推薦，依據(jù)不同
電轉(zhuǎn)儀設(shè)置針對農(nóng)桿菌合適的電擊參數(shù)）,。用紙巾擦掉電轉(zhuǎn)杯外部的水分,，將電轉(zhuǎn)杯快速放入電轉(zhuǎn)槽
中進(jìn)行電擊步驟。電擊完成后,，將電轉(zhuǎn)杯快速插入冰中,，加入700μl無抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到原來保留
的感受態(tài)空管中，28℃,，150-200rpm,，振蕩培養(yǎng)2-3小時。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,，留取200μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊,，取100μl的菌液涂布于含相應(yīng)抗生素
的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天（當(dāng)平板只含有50 μg/ml kan 時,，28℃培養(yǎng)48小時
即可,；平板中同時加入50 μg/mlKan，20μg/mlRif時,，需28℃培養(yǎng)60小時,；如果使用的平板含有50μg/mlRif
則需要28℃培養(yǎng)72-90小時）。
注意事項：
1. 混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作,，加入質(zhì)粒的體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10,，質(zhì)粒不純或超大質(zhì)粒會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化
效率急劇下降。
2. 平板上菌落過多時,，菌落很小,。為了獲得大的菌落，應(yīng)減少質(zhì)粒用量或減少涂布量,，或?qū)⒕滢D(zhuǎn)移到
新平板上生長,。
3. 使用的工作濃度濃度不應(yīng)高于25 μg/ml,，過高的濃度會降低生長速度和轉(zhuǎn)化效率。
4. 具有防止雜菌生長篩選農(nóng)桿菌的作用,；根據(jù)所用菌株抗性加入或可防止Ti質(zhì)
粒丟失,，但不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時可不考慮添加或,，
Ti質(zhì)粒丟失的概率極低 (可忽略),。
Hoekema A, Hirsch PR, Hooykaas PJJ, Schilperoort RA (1983) Binary vector strategy based on separation of
vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid.Nature 303:179-180


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