LBA4404(pSoup)農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞

產(chǎn)品信息：

組成 BC311-01
LBA4404(pSoup) Chemically Competent Cell 20×100μl
pGs2 (100ng/μl) 1 支
儲存條件：-70℃保存,，避免反復凍融,。不適合在液氮中保存,。
基因型：Ach5 (rif R ) Ti pAL4404 (strep R ) Octopine pSoup(tetR )
產(chǎn)品介紹：
農(nóng)桿菌LBA4404菌株為Ach5型背景,，核基因中含有抗性篩選基因rif。為了便于轉(zhuǎn)化操作,，此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能
的章魚堿型Ti質(zhì)粒pAL4404,，此質(zhì)粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件，pAL4404質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功
能被破壞,，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA 順利轉(zhuǎn)移）,。pAL4404型Ti質(zhì)粒含有篩選標簽基因strep，賦予LBA4404菌株
抗性,。一些缺失農(nóng)桿菌復制相關元件（如pVS1的復制起點REP區(qū)或pVS1質(zhì)粒的STA區(qū)）的表達質(zhì)粒如pGreen,、pGreenII-62SK和pGs2等不能在LBA4404菌株中繁殖。輔助質(zhì)粒pSoup可以幫助這些不完整雙元表達質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中的復制并使LBA4404(pSoup)菌株具有四環(huán)素（Tet）抗性。適用于菸草,、番茄和煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作,。LBA4404 (pSoup)農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制備，經(jīng)pGs2質(zhì)粒檢測,，轉(zhuǎn)化效率可達10 3cfu/μg,，-70℃保存12個月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。
轉(zhuǎn)化方法：（采用凍融方法）
1. 取-70℃保存的LBA4404 (pSoup)農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞于冰水浴中融化,；
2. 無菌條件下,，向感受態(tài)細胞中加入100ng-1μg質(zhì)粒DNA（次使用，做一下預實驗,，確定所加質(zhì)粒的量）,，輕輕
混勻，冰水浴中靜置5 分鐘,；
3. 將離心管置于液氮中速凍5分鐘,；（注：可用干冰和無水乙醇混合物代替液氮）
4. 然后快速將離心管置于37℃水浴中保持5分鐘，不要晃動水面,；
5. 將離心管放回冰水浴中,，冰浴5分鐘；
6. 無菌條件下加入800μl無抗生素的2xYT,、SOB,、SOC或LB液體培養(yǎng)基，于28℃振蕩培養(yǎng)2-3小時,，菌體復蘇,；
7. 6000rpm離心1分鐘收菌，留100μl左右上清,，輕輕吹打重懸菌體,，取適量菌液，涂布于相應抗生素的LB平板上,，于28℃培養(yǎng)
箱中倒置培養(yǎng)48-72小時,。（實驗表明當平板只含有50μg/ml的Kan時，28℃培養(yǎng)48 h即可看到菌落,；平板中含有50 μg/ml Kan
和20 μg/ml Rif 時,，需28℃培養(yǎng)60 h可看到菌落； 如果平板中含有50 μg/ml Kan和50 μg/ml Rif時則需要28℃培養(yǎng)72-90 h可看
到菌落）,。
注意事項：
1. 加入質(zhì)粒時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10,；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降,；質(zhì)粒增大一倍,，轉(zhuǎn)化
效率下降一個數(shù)量級,。
2. 混入質(zhì)粒時應輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量,。
3. 平板上陽性克隆密度過大時，由于營養(yǎng)不足,，陽性克隆生長變慢,，菌落變小，為了獲得大的菌落,，應減少質(zhì)粒用量,。
4. 濃度不應高于25 μg/ml，過高的濃度不利于農(nóng)桿菌生長,，會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率,。
5. 培養(yǎng)基中加入的目的是防止雜菌生長和篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入Ti 質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti 質(zhì)粒丟失,，
但Ti 質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作,，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮這些抗生素，Ti 質(zhì)粒丟失的概率極低(可以
忽略),。
6. 相關抗生素配制及工作濃度：
（Rif）用DMSO配制成20mg/ml的儲存液,，工作濃度為20μg/ml。（Tet）用甲醇溶解成10mg/ml的儲存液,，
工作濃度為10μg/ml,。硫酸（Kan）、硫酸（Strep）,、硫酸（Gent）和羧芐鈉鹽（Carb）分別
用雙蒸水配制成濃度為50mg/ml,，50mg/ml、40mg/ml和50mg/ml的儲存液,，并用0.22μg濾器過濾除菌,。工作濃度分別為
Kan:50μg/ml，Strep:50μg/ml,，Gent:40μg/ml和Carb:50μg/ml,。


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重組蛋白：多項發(fā)明,，原核表達系統(tǒng)穩(wěn)定表達蛋白 1000 余種。


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