3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)測試盒微量法

本公司所有產(chǎn)品僅供科學(xué)實(shí)驗(yàn),，不做其他科學(xué)實(shí)驗(yàn)外的使用,！
商品屬性：

測定意義：

GAPDH 催化 3-磷酸甘油醛氧化生成 1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶,，與糖異生途徑,、體內(nèi)血糖濃度的維持和糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，在機(jī)體糖,、脂,、蛋白代謝紊亂疾病中發(fā)揮重要作用。

測定原理

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和 ATP 生成 1,3 二磷酸甘油酸。GAPDH 逆向催化 1,3二磷酸甘油酸和 NADH 生成 3 磷酸甘油醛,、無機(jī)磷和 NAD,，340nm 處測定 NADH 的減少量可反映 GADPH 活性的高低。需自備的儀器和用品分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、恒溫水浴鍋,、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96 孔板,、研缽、冰和蒸餾水,。

試劑的組成和配制:

提取液一：液體 100mL×1 瓶,，4℃保存。

提取液二：液體 100mL×1 瓶,，4℃保存,。

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存,；

試劑二：液體 20mL×1 瓶,，4℃保存；

試劑三：液體 14uL×1 支,，4℃保存,；

組織樣本的前處

①總 GAPDH 酶提取：建議稱取約 0.1g 樣本,，加入 1mL 提取液一,，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W,，破碎 3s,，間歇 7s,，總時(shí)間 1min）,，然后 4℃，8000g 離心 10min,，取上清測定,。

②胞漿和葉綠體 GAPDH 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5～10的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1mL 提取液一）,，冰浴勻漿后于 4℃,，200g 離心 5min，棄沉淀,，取上清4℃,，8000g 離心 10min，取上清用于測定胞漿 GAPDH 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二,，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴,，200W，破碎 3s,，間歇 7s,，總時(shí)間 1min），然后 4℃,，8000g 離心 10min,，取清測定葉綠體中 GAPDH 酶活性。建議測定總 GAPDH 酶活性,，按照步驟①提取粗酶液,，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的GAPDH，則按照步驟②提取粗酶液,。細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的前處理先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液一）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功率 20％或 200W，超聲 3s,，間隔 10s,，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測。

測定步驟:

1,、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零,。

2,、 樣本測定

（1）工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中，充分溶解,，37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 10 分鐘,；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融,。

（2）在試劑三中加入 500μL 蒸餾水,，充分混勻待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存,，禁止反復(fù)凍融,。

（3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μL 樣本,、5μL 試劑三和 190μL 工作液，混勻,，加入最后一個(gè)試劑的同時(shí)開始計(jì)時(shí),，記錄 340nm 處 20s 時(shí)的吸光值 A1 和 5min20s 后的吸光值 A2，計(jì)算 ΔA=A1-A2,。

GAPDH 活性計(jì)算

a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位,。GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=1286×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每一萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位,。GAPDH（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T=2.572×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10-4L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×103L / mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；V 樣：加入樣本體積,，0.005 mL；V 樣總：加入提取液體積,，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬,。

b.用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位,。GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=2572×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每一萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位,。GAPDH（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 樣÷V 樣總) ÷T=5.144×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10-4L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù),，6.22×103L / mol /cm,；d：96 孔板光徑,，0.5cm,；V 樣：加入樣本體積，0.005 mL,；V 樣總：加入提取液體積,，1 mL,；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬,。

生化試劑盒的使用注意事項(xiàng)：

選擇合適的試劑盒：根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜋z測對象選擇合適的試劑盒,，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。

嚴(yán)格遵循說明書：按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作,，避免誤用或浪費(fèi),。

注意保存條件：按照試劑盒的保存條件進(jìn)行妥善保存，避免陽光直射,、高溫或潮濕等不利因素,。

控制實(shí)驗(yàn)條件：在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，如溫度,、時(shí)間,、pH值等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性,。

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