穩(wěn)定細胞株篩選 流式

摘要：本實驗使用過表達human Oct-4-EGFP的慢病毒感染HeLa細胞。該病毒的表達框為pLenti-CMVOct-4-EGFP-3FLAG-PGK-Puro： CMV啟動子驅(qū)動Oct-4-EGFP基因的表達,， 同時由PGK啟動子驅(qū)動 puromycin抗性基因的表達,。在感染HeLa細胞72h后，通過加入并維持2μg/μL的puromycin殺死未被有效感染的細胞,。從而在puromycin藥物的維持下最終獲得Oct-4-EGFP穩(wěn)定表達的混合穩(wěn)定株,。

關(guān)鍵詞：Oct-4-EGFP，穩(wěn)定細胞株,， HeLa,，慢病毒

一、 實驗原理

外源基因在細胞中的表達可分為兩大類,，一類是瞬時表達,，一類是穩(wěn)定表達（永jiu表達）。前者外源 DNA/RNA不整合到宿主染色體中,，雖然可以達到高水平的表達,，但通常只持續(xù)幾天。后者外源DNA整合到宿主細胞染色體上,，使宿主細胞可長期表達目的基因,。建立穩(wěn)定細胞株，一般是根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應(yīng)的藥物對靶細胞進行篩選,。常用的抗性標記基因有潮霉素（hygromycin）,、新霉su（neomycin）和嘌呤霉素（puromycin），常用Hygromycin B,、G418和puromycin進行選擇性篩選,。 傳統(tǒng)的穩(wěn)定株篩選方法需要通過外源基因的瞬時轉(zhuǎn)染后對靶細胞進行篩選， 最終獲得從單一細胞擴增起來的穩(wěn)定細胞株,， 該方法陽性率低,，周期長，工作量大,。慢病毒是一種RNA病毒,，攜帶的外源基因在病毒感染細胞后需要逆轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細胞基因組以后才能表達,。 利用慢病毒必須整合到宿主基因組的特性來篩選穩(wěn)定株的方法克服了傳統(tǒng)方法的弊端,，可以在短時間內(nèi)獲得高效率的穩(wěn)定細胞株,。篩選得到的細胞或者可穩(wěn)定表達目的蛋白，用于蛋白的擴增和富集,；或者得到穩(wěn)定沉默特定基因的細胞株,。

二、 實驗?zāi)康?/span>

通過慢病毒感染配合藥物篩選的方法獲得穩(wěn)定表達Oct-4-EGFP的HeLa穩(wěn)定細胞株,。

三,、 實驗步驟

實驗共分以下3個主要步驟：

1. 細胞鋪板 將HeLa細胞按30%的融合度接種到24孔板：

1) HeLa細胞配成1×105 cells/mL細胞懸液，待鋪板,。

2) 每孔鋪500μL,，即5×104 cells/well，鋪1塊24孔板,。

2. 感染慢病毒 12~20h后感染慢病毒：

1) 根據(jù)公式計算病毒用量： （細胞數(shù)×MOI值/病毒原液滴度）×103=病毒用量（μL）,。

2) 本實驗中MOI取10，吸去與加入病毒體積相同培養(yǎng)基,。

3) 每孔加2.5μL的polybrene (1mg/mL),，使polybrene終濃度達到5μg/mL。

4) 24h后換,，棄去培養(yǎng)基后每孔加入500μL新鮮的培養(yǎng)基,。

3. 穩(wěn)定株篩選

1) 72h以后，加入終濃度2μg/μL puromycin,。每隔2-3天換一次終濃度2μg/μL puromycin新鮮培養(yǎng)基,。

2) 藥物篩選約10天后，拍熒光照片,。

3) 穩(wěn)定細胞株凍存,。

四、 實驗結(jié)果

圖1. 慢病毒感染HeLa細胞72h后熒光照片,，MOI為10

圖2. 慢病毒感染HeLa細胞,，篩選10天后穩(wěn)定株熒光照片

結(jié)論：從圖1可以看到,，在MOI為10條件下,，HeLa的感染效率約為80%。根據(jù)圖2,，使用puromycin藥物篩選10天后,，表達目的基因的HeLa的比例在90%以上，且熒光亮度增強,。Oct-4-EGFP穩(wěn)定表達的HeLa細胞株篩選成功,。

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