生物細(xì)胞培養(yǎng)遷移侵襲MTT轉(zhuǎn)染流式分選誘導(dǎo)

一、服務(wù)介紹

細(xì)胞遷移是指細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng),。細(xì)胞遷移為細(xì)胞頭部偽足的延伸,、新的黏附建立、細(xì)胞體尾部收縮在時(shí)空上的交替過程,。細(xì)胞遷移是正常細(xì)胞的基本功能之一,，是機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育的生理過程，也是活細(xì)胞普遍存在的一種運(yùn)動(dòng)形式,。胚胎發(fā)育,、血管生成、傷口愈合,、 免疫反應(yīng),、炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化,、癌癥轉(zhuǎn)移等過程中都涉及細(xì)胞遷移,。檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的實(shí)驗(yàn)包括劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)。

二,、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是簡(jiǎn)捷測(cè)定細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)與修復(fù)能力的方法,，在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上， 用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中yang區(qū)域劃線,，去除中yang部分的細(xì)胞,，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間是一種簡(jiǎn)單易行的檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方法,，實(shí)驗(yàn)成本低，可以用來檢測(cè)貼壁生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,。Transwell的基本原理是將transwell小室放入培養(yǎng)板中,，小室內(nèi)稱為上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱為下室,，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔,，上室內(nèi)添加上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)添加下層培養(yǎng)液,。將細(xì)胞種在上室內(nèi),，由于膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞,，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng),、運(yùn)動(dòng)等的影響。

三,、實(shí)驗(yàn)流程

劃痕實(shí)驗(yàn)

1. 用marker筆在6孔板背后均勻得劃橫線,；

2. 在孔中加入細(xì)胞；

3. 第二天用槍頭垂至于背后的橫線劃痕,；

4. 用PBS洗去處劃下的細(xì)胞,，培養(yǎng)不同時(shí)間，取樣,，拍照,；

5. 數(shù)據(jù)處理：每個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞整體遷移距離=每個(gè)時(shí)間點(diǎn)距離長(zhǎng)度-0時(shí)距離；

6. 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析,。 

遷移實(shí)驗(yàn)（cell migration assay）

實(shí)驗(yàn)材料

（1）Transwell chamber: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Corning)

（2）細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：無血清培養(yǎng)基,，10％血清培養(yǎng)基，PBS,，0.02％EDTA

（3）固定液：甲醇

（4）染色液：Giemsa染液

（5）封片劑：中性樹膠

（6）其他：小鑷子,，棉棒，載玻片,，蓋玻片

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) （cell invasion assay）

實(shí)驗(yàn)材料

（1）Matrigel (BD 5mg/ml),，-20℃保存

（2）其余材料同遷移實(shí)驗(yàn) 操作步驟

（3）Matrigel在4℃過夜融化；

（4）用4℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度1mg/ml,，冰上操作,；

（5）在chamber上室底部zhong央垂直加入100μl稀釋后的Matrigel，37℃溫育4－5小時(shí)使其干成膠狀,；

（6）后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)（1-8）,。

注意事項(xiàng)

（1）Matrigel在過高或過低的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應(yīng)提前在4℃預(yù)冷,； （2）鋪膠時(shí)保證液面水平,，膠的厚度均勻一致,，切勿產(chǎn)生氣泡；

（2）其他注意事項(xiàng)同遷移試驗(yàn),。

Transwell實(shí)驗(yàn)

1. 采用未鋪 Matrigel 膠的 Transwell 小室用于實(shí)驗(yàn),；

2. 制備細(xì)胞懸液；

3. 接種細(xì)胞,；

4. 檢測(cè)穿過的細(xì)胞數(shù),；

5. 結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。 

注意事項(xiàng)

（1）根據(jù)待測(cè)細(xì)胞體積大小選擇合適孔徑的chamber,。常用的為8.0-μm孔徑（如AGS細(xì)胞）,，如果細(xì)胞 體積較大可以考慮用10-μm孔徑；

（2）根據(jù)待測(cè)細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)弱調(diào)整細(xì)胞數(shù)和遷移時(shí)間,。常規(guī)24-well chamber接種細(xì)胞數(shù)約為 2≈5×104/well,，遷移時(shí)間12≈36小時(shí)；

（3）由于Corning公司的24-Transwell內(nèi)含12個(gè)獨(dú)立的chamber,，為了避免操作污染,，每次實(shí)驗(yàn)可預(yù)先另準(zhǔn)備一塊24孔普通培養(yǎng)板（Corning）,；

（4）如果細(xì)胞遷移能力較弱,，下室液體可用3T3細(xì)胞無血清培養(yǎng)24小時(shí)獲得的上清加50μg/ml FN （Fibronectin），具體可查閱相關(guān)文獻(xiàn),；

（5）細(xì)胞懸液加入膜zhong央,，盡量保證液面水平；

（6）固定染色擦洗時(shí)動(dòng)作小心,，避免擦去膜底面的細(xì)胞,。但一定要充分擦凈膜表面上未遷移的細(xì)胞，以 免影響讀數(shù),。尤其是膜周邊上可用細(xì)牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗,，但要小心避免將膜戳破；

（7）Chamber和膜上都無法標(biāo)記,，操作時(shí)應(yīng)小心避免混淆實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,；

（8）充分晾干，避免殘留水分導(dǎo)致鏡下聚焦不一致,。

四,、服務(wù)說明

1. 客戶提供：細(xì)胞株(凍存株或培養(yǎng)好的細(xì)胞)，所需藥品,，藥物處理方式和濃度,。

2. 公司提供：基本實(shí)驗(yàn)步驟、圖片,、數(shù)據(jù)分析結(jié)果,、剩余藥品,。

3. 實(shí)驗(yàn)周期：大約2-3周左右，具體需要根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及實(shí)驗(yàn)內(nèi)容而定,。

服務(wù)對(duì)象：

1,、在職或?qū)Ｂ毰R床研究生、博士生

● 實(shí)驗(yàn)室條件的不完備

● 文章設(shè)計(jì)不完善

● 臨床工作繁忙

● 實(shí)驗(yàn)條件摸索不成熟

● 科研時(shí)間嚴(yán)重不足

● ……

2,、地市級(jí)三級(jí)醫(yī)院科室主任,、主任醫(yī)師、主治醫(yī)師等

● 公務(wù)繁忙

● 無精力,、時(shí)間查找文獻(xiàn)

● 沒有時(shí)間尋找領(lǐng)域內(nèi)新熱點(diǎn)

● 科研圈子氛圍不夠濃厚

● 需要更前沿的科研技術(shù)應(yīng)用

● 晉升,、晉職需要

● ……

3、繁重科研任務(wù)的臨床醫(yī)生

● 文章設(shè)計(jì)不完善

● 科研任務(wù)繁重忙不過來

● 臨床工作繁忙,，千頭萬緒

● 周圍環(huán)境和條件的局限

● 缺少實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

● ……

4,、有志于科研的各級(jí)醫(yī)院臨床醫(yī)生/護(hù)士

● 奮戰(zhàn)在病房一線

● 時(shí)間都給了病人

● 有志于科研

● 心有余而力不足

● ……

整體外包服務(wù)介紹：星森林生物提供科研設(shè)計(jì)咨詢及輔助實(shí)施：相關(guān)文獻(xiàn)查閱、實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì),、實(shí)驗(yàn)可行性分析,、基金標(biāo) 書撰寫、課題項(xiàng)目申請(qǐng),、整體實(shí)驗(yàn)實(shí)施,、數(shù)據(jù)分析與處理、結(jié)題報(bào)告書寫以及課題相關(guān)資料培訓(xùn),。

● 根據(jù)客戶研究方向,、基金標(biāo)書、實(shí)驗(yàn)課題外包目標(biāo)和要求,，實(shí)驗(yàn)預(yù)算等設(shè)計(jì)可操作執(zhí)行的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方 案,。

● 根據(jù)客戶研究團(tuán)隊(duì)的研究基礎(chǔ)，幫助客戶策劃,、設(shè)計(jì)可執(zhí)行的研究路線及實(shí)驗(yàn)方案,。

● 幫助客戶解決實(shí)驗(yàn)方案中需要突破的重要實(shí)驗(yàn)問題，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程,。

● 指導(dǎo)客戶篩選和確定實(shí)驗(yàn)方案中所需要的試劑,、抗體及相關(guān)耗材。

● 根據(jù)客戶需求推薦適合客戶的其他增值外包服務(wù),。

收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果：

歡迎咨詢?cè)斦?，我們?huì)根據(jù)您的方案及需求制定詳細(xì)的服務(wù)協(xié)議。

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