轉基因大豆MON87705品系試劑盒(熒光-PCR法)

產品名稱】

通用名稱：轉基因大豆 MON87705 品系核酸檢測試劑盒 (熒光-PCR 法)

Name ：Diagnostic Kit for MON87705 Gene DNA (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

本試劑盒適用于檢測轉基因植物的 MON87705 基因,，用于篩查待檢測植物中是否含有 MON87705 成分,。其檢測結果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒用國家標準的 MON87705 特異性引物和探針,，用熒光 PCR 技術進行轉基因成分的檢測,。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃避光保存,、運輸,、避免反復凍融，反復凍融次數不超過 5 次,。有效期 12 個月,。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P,、MJ Opticon2,、LightCycler480、Bio-Rad,、eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀,。

【標本采集】稱取 200g 樣品。【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃,，長期保存可置-70℃,，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 0℃,。

轉基因大豆MON87705品系試劑盒(熒光-PCR法)使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

固體樣本：用粉碎機或冷凍研磨儀將樣品研磨至細粉狀,。

1.2 DNA 提取

對于固體標本，DNA 的提取可以采用 SN/T 2584-2010 中推薦的方法：

1) 每個樣品取 2 個平行管,。稱取 200mg 粉碎的樣品,，加入 1mL 預冷至 4℃的抽提液，劇烈搖動混勻后,，在冰上靜止 5min,，4℃條件下 10000g 離心 15min，棄上清液,；

2) 加入 600μL 預熱至 65℃的裂解液，充分重懸沉淀,，在 65℃恒溫保持 40min,， 期間顛倒混勻 5 次,；

3) 室溫條件下10000g 離心10min，取上清液轉移至新離心管中,，加入5μLRNAseA,， 37℃恒溫 30min，分別用等體積苯酚：異戊醇溶液：異戊醇溶液各抽提一次,；

4) 室溫條件下,，10000g 離心 10min，取上清液至新離心管,，加入三分之二體積的異丙醇,，十分之一體積的 3mol/L 的乙酸鈉溶液（pH=6.5），-20℃放置 2-3h,；

5) 在 4℃條件下,，10000g 離心 15min，棄上清液,，用 70%乙醇洗滌沉淀一次,，倒出乙醇，晾干沉淀,；

6) 加入 50μL TE（pH8.0）溶解沉淀,，所得溶解即為樣品 DNA 溶液。也可使用等效的 DNA 提取試劑盒,。

油脂樣本請直接選用市售油脂 DNA 提取試劑盒,，按說明操作。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據待檢測樣本總數,，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照,；樣品每滿 7 份，多配制 1 份),，每測試反應體系配制如下表：

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的 DNA,、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL,，加入相應的反應管中,，蓋好管蓋，混勻,，短暫離心,。

4. PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

1.1 設置好通道,、樣品信息,，反應體系設置為 25μL；熒光通道選擇： 檢測通道

（Reporter Dye）FAM,， 淬滅通道（Quencher Dye）選擇 NONE,，請勿選擇 ROX 參比熒光,。

1.2 推薦循環(huán)參數設置：

轉基因大豆MON87705品系試劑盒(熒光-PCR法) 結果分析判定

結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時,，根據分析后圖像調節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調節(jié)),、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節(jié))，以及Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),，重新分析結果,。

 結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲線有明顯的指數增長曲線,；

可疑：檢測通道 35<Ct 值≤38,，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35<Ct 值≤ 38,，且曲線有明顯的增長曲線,，判定為陽性，否則為陰性,；

陰性：樣本檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值,。

3. 質控標準

陰性質控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期,，且 Ct 值≤32,； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效,。