辛辛苦苦提完 RNA,，逆轉錄后一個個孔加完引物和模板,，Z后進行 RT-PCR，你以為這樣就可以美滋滋地坐等結果了,？等到一幅下面這樣的結果圖,，不知道對于剛接觸 RT-PCR 的你來說內心是否是崩潰的？

這是啥,？怎么看,？

別急，讓我慢慢跟你介紹,，看完后你就能準確的分析出你的 RT-PCR 結果了,。「這里以 7500 軟件為例進行介紹」

1. 首先設置好內參和對照組「在 Analysis Settings 處」,，一般我們在上機前會對應設置好的,，如果設置好的話可以直接跳至第 3 點。如果沒有設置好的話是需要重新進行設置,。

2. 點擊進去后,，選擇對應好的內參和對照組?！冈?Relative Quantization Settings 選項下」

3.選擇好內參和對照組后,，我們首先看看 PCR 跑的有沒有問題，在這里大家Z常會見到的問題是在樣品池出現(xiàn)了三角形符號,，如下圖：

那么這些三角形代表什么意思,？沒錯，聰明的你應該已經想到是這個孔出現(xiàn)了問題,，而三角形中的數(shù)字是幾則代表了孔中有幾個問題,。具體又是什么問題呢？我們就要通過 analysis 中的 QC Summery 進行查找。

舉個栗子,，比如圖中的 A9 孔,，出現(xiàn)了 2，則表示有 2 個問題,，第 1 個問題如上圖所示,，High standard deviation 高的標準偏差，表示可能是你上樣時導致的樣品復孔之間差異較大,。第二個問題則是下圖中,，系統(tǒng)認定 A9 孔中的數(shù)值偏差較大，屬于異常值,。

當然,，還有比較常見的問題是引物二聚體引起的雙重峰，如 A4 孔,。

4. 溶解曲線「melt curve」：表示隨溫度升高 DNA 的雙螺旋結構降解程度的曲線?？偟?DNA 雙螺旋結構降解一半的溫度稱為熔解溫度「Tm」,，不同序列的 DNA,，Tm 值不同,。DNA 中 G-C 含量越高,，Tm 值越高,，成正比關系。正如上面提到的,，正常的樣品孔溶解曲線應該是單峰的，如下圖,。如果出現(xiàn)了雙峰，則要考慮是否引物設計不合理或者引物過量引起溶解曲線出現(xiàn)多峰的情況,。

5. 如果前面的幾項都沒有太大的問題的話。Z后我們看看Z重要的結果,，也就是目的基因的變化情況了。在內參與對照組選擇沒錯的情況下,，點擊 gene expression 選項,，選中你想查看的樣品孔的基因表達情況。

好了,，這次的 RT-PCR 看圖分析就到這里。Z后需要注意的是圖中的結果還需要輸出進行后續(xù)的自行運算得出結果,。圖中的結果只能給出參考。但大致趨勢是相同的,，如果還有童鞋想聽后續(xù)如何計算 RT-PCR 的結果及原理的話,，歡迎關注下期的 RT-PCR 結果的計算原理與計算模板,。