一,、自噬誘導(dǎo)劑  

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

(2) Carbamazepine/ L-690,，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）

(3) Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓

(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑

(5) Rapamycin：mTOR抑制劑

(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑

二,、自噬抑制劑  

(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑

(2) Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑

(3) Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）

除了選用上述工具藥外,，一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對自噬相關(guān)基因進行干預(yù)：包括反義RNA干擾技術(shù)（Knockdown）、突變株篩選,、外源基因?qū)氲取?/span>

三,、自噬過程進行觀察和檢測 

細胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后，需對自噬過程進行觀察和檢測,，常用的策略和技術(shù)有：

1,、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到,，因此,，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。phagophore的特征為：新月狀或杯狀,，雙層或多層膜,，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體（**1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu),，內(nèi)含胞漿成分,，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng),、核糖體等,。自噬溶酶體（**2）的特征為：單層膜，胞漿成分已降解,。（autophagic vacuole,，**）

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成

由于電鏡耗時長,，不利于監(jiān)測（Monitoring）自噬形成,，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。無自噬時,，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中,；自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜,，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點,，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低,。

3,、利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成

自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3-I）會酶解掉一小段多肽,，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II）,，因此，LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低,。

（注意：LC3抗體對LC3-II有更高的親和力,，會造成假陽性。方法2和3需結(jié)合使用,，同時需考慮溶酶體活性的影響,。）

4、檢測長壽蛋白的批量降解：非特異

5,、MDC（Monodansylcadaverine,，單丹磺酰尸胺）染色：包括自噬體，所有酸性液泡都被染色,，故屬于非特異性的,。

6、CellTrackerTM Green染色：主要用于雙染色,，但其能染所有的液泡,，故也屬于非特異性的。

四,、自噬相關(guān)蛋白的定位 

在研究自噬相關(guān)蛋白時,，需對其進行定位。由于自噬體與溶酶體,、線粒體,、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體關(guān)系密切,，為了區(qū)別,，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位：

Lamp-2：溶酶體膜蛋白，可用于監(jiān)測自噬體與溶酶體融合,。

LysoTrackerTM 探針：有紅或藍色可選,，顯示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito：載體,，轉(zhuǎn)染后表達一個融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號）,，可用來檢測線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）。

MitoTraker探針：特異性顯示活的線粒體,，熒光在經(jīng)過固定后還能保留,。

Hsp60：定位與線粒體基質(zhì)，細胞死亡時不會被釋放,。

Calreticulin（鈣網(wǎng)織蛋白）：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔

（注意：這些蛋白均為胞漿蛋白,，爬片或胰酶消化的細胞在做免疫熒光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS處理,。）