大鼠神經(jīng)元原代培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

一、背景

神經(jīng)元原代培養(yǎng)是將胚胎哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部分組織,，如大腦皮層、海馬,、脊髓等腦組織直接取出,，再接種培養(yǎng)的方法。目前國(guó)內(nèi),、外有關(guān)神經(jīng)元培養(yǎng)的方法較多,，但在原代培養(yǎng)中神經(jīng)元的純度和產(chǎn)量方面還存在一些急待解決的問(wèn)題。由于神經(jīng)元是一種高度分化的細(xì)胞,，相對(duì)于其它細(xì)胞而言,，神經(jīng)元在體外更難以存活和生長(zhǎng)。因此,，體外培養(yǎng)神經(jīng)元要求的培養(yǎng)方法和營(yíng)養(yǎng)條件均較為特殊,。

神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)是研究神經(jīng)源性疾病的發(fā)病機(jī)制、進(jìn)程的一個(gè)重要工具,，能很好的,、直觀的反映離體神經(jīng)元的發(fā)育狀況和生理活性，如何建立一個(gè)穩(wěn)定成熟的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)體系是神經(jīng)系統(tǒng)疾病體外實(shí)驗(yàn)研究順利進(jìn)行的基礎(chǔ),。隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)研究的逐漸深入,，神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)在腦損傷、神經(jīng)障礙性疾病,、衰老相關(guān)神經(jīng)疾病方面得到廣泛重視和普及應(yīng)用,。

二、大鼠神經(jīng)元原代培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟

(1)75% (體積分?jǐn)?shù))酒精消毒孕鼠,在無(wú)菌條件下取出胎鼠,分離并切取脊髓,置于冷的無(wú)鈣,、鎂的HBSS液的平皿中( 下置冰袋),。

(2)解剖顯微鏡無(wú)菌條件下仔細(xì)剝離脊膜及血管,。

(3)用彈簧剪將脊髓剪成1cm3大小，消化液37℃消化15-20min,，每五分鐘振蕩一次,；

(4)去掉上清，加入終止液終止消化,，吹打10-15次,，不能有氣泡，收集上清,，剩余組織再消化一次。

(5)4℃1000rpm離心10min,，棄上清,，加入種植液1重懸，培養(yǎng)箱內(nèi)差速貼壁30min,；

(6)收集上清,，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，按6*105cells/孔種入六孔板（種植液1）,，37℃,，5%CO2，95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；

(7)培養(yǎng)第二天,，全換液更換為種植液2；

(8)培養(yǎng)第四天,，半量換液加入5uM的阿糖胞苷,，24h全量換液；

(9)之后每周換液兩次,。