多肽合成（化學(xué)）方法,，包括液相和固相兩種方法。液相多肽合成方法現(xiàn)在主要采用BOC和Z兩種保護(hù)方法,，現(xiàn)在主要應(yīng)用在短肽合成,，如阿斯巴甜，力肽,，催產(chǎn)素等,，其相對與固相多肽合成，具有保護(hù)基選擇多,，成本低廉,，合成規(guī)模容易放大的許多優(yōu)點。與固相多肽合成比較,，液相多肽合成主要缺點是,，合成范圍小,，一般都集中在10個氨基酸以內(nèi)的多肽合成，還有合成中需要對中間體進(jìn)行提純,，時間長,，工作量大。固相多肽合成方法現(xiàn)在主要采用FMOC和BOC兩種方法,，它具有合成方便,，迅速，容易實現(xiàn)自動化,，而且可以比較容易的合成到30個氨基酸左右多肽,。

1.1．氨基酸保護(hù)基

20種常見氨基酸，根據(jù)側(cè)鏈可以分為幾類：脂肪族氨基酸（Ala,，Gly,，Val，Leu,，Ile,，），芳香族氨基酸（Phe,，Tyr,，Trp，His）,，酰胺或羧基側(cè)鏈氨基酸（Asp,，Glu，Asn,，Gln）,，堿性側(cè)鏈氨基酸（Lys，Arg）,，含硫氨基酸（Cys,，Met），含醇氨基酸（Ser,，Thr）,，亞氨型基酸（Pro）。多肽化學(xué)合成中氨基酸的保護(hù)非常關(guān)鍵,，直接決定了合成能夠成功的關(guān)鍵,。因為常見的20中氨基酸中有很多都是帶有活性側(cè)鏈的，需要進(jìn)行保護(hù),，一般要求,，這些保護(hù)基在合成過程中穩(wěn)定，無副反應(yīng),，合成結(jié)束后可以*定量的脫除,。合成中需要進(jìn)行保護(hù)的氨基酸包括：Cys,，Asp，Glu,，His,，Lys，Asn,，Gln,，Arg，Ser,，Thr,，Trp，Tyr,。需要進(jìn)行保護(hù)的基團(tuán)：羥基,，羧基，巰基,，氨基,，酰胺基，胍基,，吲哚,，咪唑等。其中Trp也可以不保護(hù),，因為吲哚性質(zhì)比較穩(wěn)定,。當(dāng)然在特殊的情況下，有些氨基酸也可以不保護(hù),，象,，Asn，Gln ,，Thr，Tyr,。

表1 常見3種氨基脫除條件

圖1 常見3種氨基保護(hù)基結(jié)構(gòu)

氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)非常多,，同一個側(cè)鏈有多種不同的保護(hù)基，可以在不同的條件下選擇性的脫除,，這點在環(huán)肽以及多肽修飾上具有很重要的意義,。而且側(cè)鏈保護(hù)基和選擇的合成方法有密切的關(guān)系，液相和固相不一樣,，固相中BOC和FMOC策略也不一樣,，從某種意義上看，多肽化學(xué)就是氨基酸保護(hù)基的靈活運用與搭配,。關(guān)于側(cè)鏈保護(hù)基的使用,，請參考王德心的《固相有機(jī)合成——原理及應(yīng)用指南》第四章,，我們這里主要介紹Cys，Lys,，Asp的幾種保護(hù)基及其脫除方法,。Cys  見的保護(hù)基有三種，Trt,，Acm,，Mob，這三個保護(hù)基可以完成多對二硫鍵多肽的合成,。Lys  見的保護(hù)基有：Boc,，F(xiàn)moc，Trt,，Dde,，Allyl，這對于固相合成環(huán)肽提供了很多正交的保護(hù)策略,。Asp  見的保護(hù)基有：Otbu,，OBzl，OMe,，OAll,，OFm，同樣也提供了多種正交的保護(hù)策略,。

表2 巰基常見保護(hù)基

1.2．多肽縮合試劑

目前多肽合成中,，主要采用羧基活化方法來完成接肽反應(yīng)，早使用的是將氨基酸活化為酰氯,，疊氮,，對稱酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于這些條件下,，存在氨基酸消旋,，以及反應(yīng)試劑危險以及制備比較復(fù)雜，逐漸被后來的縮合試劑取代,，按照其結(jié)構(gòu)可以分為兩種：縮合試劑主要有：碳二亞胺型,，鎓鹽型（Uronium）。

1.2.1．碳二亞胺型

主要包括：DCC,，DIC,，EDC.HCl等。采用DCC進(jìn)行反應(yīng),，由于反應(yīng)中生成的DCU,，在DMF中溶解度很小，產(chǎn)生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中,，但是由于其價格便宜,，在液相合成中，可以通過過濾除去,，應(yīng)用仍然相當(dāng)廣泛,。EDC.HCl因為其水溶解性的特點，在多肽與蛋白的連接中使用比較多,，而且也相當(dāng)成功,。但是該類型的縮合試劑的一個大的缺點，就是如果單獨使用,，會有比較多的副反應(yīng),，但是研究表明如果在活化過程中添加HOBt，HOAt等試劑,，可以將其副反應(yīng)控制在很低的范圍,。其反應(yīng)機(jī)理如下：

圖2  DIC活化反應(yīng)機(jī)理

1.2.2．鎓鹽型

鎓鹽型縮合試劑反應(yīng)活性高，速度快,，現(xiàn)在使用非常廣泛,，主要包括：HBTU，TBTU,，HATU,，PyBOP等。該試劑使用過程中需要添加有機(jī)堿,，如,，二異丙基乙胺（DIEA），N-甲基嗎啉（NMM）,，該試劑加入后,，才能活化氨基酸。其反應(yīng)機(jī)理如下：

圖3  TBTU活化反應(yīng)機(jī)理

1.3．多肽合成方法比較

1.3.1．液相多肽合成（solution phase synthesis）

液相多肽合成現(xiàn)在仍然廣泛的使用,，在合成短肽的多肽合成和多肽片段的多肽合成上具有多肽合成規(guī)模大,，多肽合成成本低的顯著優(yōu)點，而且由于是在液相中進(jìn)行反應(yīng),，可以選擇的反應(yīng)條件更加豐富,，像一些催化氫化，堿性水解等條件,，都可以使用,，這在固相多肽合成中,，使用卻由于反應(yīng)效率低,，以及副反應(yīng)等原因，無法應(yīng)用。液相多肽合成中主要采用BOC和Z兩種反應(yīng)策略,。

固相多肽合成現(xiàn)在使用的主要有兩種策略：BOC和FMOC兩種,。BOC方法在多肽合成過程中，需要反復(fù)使用TFA脫BOC,，而且在后將多肽從樹脂上切割下來需要使用HF,，由于HF必須使用專門的儀器進(jìn)行操作，而且多肽切割過程中容易產(chǎn)生副反應(yīng),，因此現(xiàn)在使用受到實驗條件限制,，使用也逐漸減少。FMOC方法反應(yīng)條件溫和,，在一般的實驗條件下就可以進(jìn)行多肽合成,，因此，也得到了非常廣泛的應(yīng)用,。

圖4液相合成Glu-Trp

1.3.2.1．固相合成中常用樹脂

固相多肽合成中樹脂,，一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150μm,，交聯(lián)度在1-2%之間,，現(xiàn)在使用的大多是1%，因為這種交聯(lián)度下,，樹脂在DMF,，DCM中具有很好的溶脹性能，立體上是一個空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),，反應(yīng)物分子可以在樹脂內(nèi)部自由移動,。樹脂中關(guān)鍵的部分是連接手臂，它一端連接在樹脂上,，一端作為反應(yīng)位點,。目前廣泛使用的樹脂有：PAM，MBHA,，Wang,，2-Cl-Trt，Rink-Amide-MBHA等,。其中PAM,，MBHA是用在BOC策略中，因為其對酸非常穩(wěn)定,，需要在HF,，TFMSA等強(qiáng)酸條件下才能夠切割下來。

圖6  固相合成常用樹脂

1.3.2.2．茚三酮檢測

固相多肽合成中,，主要是通過檢測樹脂上游離氨基來判斷連接效率,，檢測方法稱為Kaiser方法,，其檢測結(jié)果，如果有游離氨基的時候,，顯示蘭色,，或紅褐色（pro，ser,，His）,。

Kaiser試劑包括：

A，6% 茚三酮的乙醇溶液

B,，80% 苯酚的乙醇溶液

C,，2% 0.001M KCN的吡啶溶液

配制中的吡啶需要經(jīng)過茚三酮處理后，重蒸后再使用,。檢測過程,，取少量樹脂，加入A,，B,，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min,，如果溶液有蘭色,，或樹脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色,，表明還有游離氨基,，否則說明連接*。

還有其它檢測游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法,，  法,，溴芬蘭法等。

圖7 茚三酮檢測原理

1.3.2.3．固相合成切割方法

固相多肽合成完成之后,，必須選擇合適的切割試劑將多肽從樹脂上切割下來,，然后經(jīng)過冰  沉淀，離心收集沉淀,，經(jīng)過HPLC分離純化,，冷凍干燥得到后多肽產(chǎn)品。由于選擇的樹脂不同,，氨基酸序列不同,，在切割時候，選擇的切割方法也不*相同,，一般都是選擇酸性條件下切割的條件,，對于PAM，MBHA樹脂,，一般采用HF切割,，切割過程中需要添加對甲苯酚,，對巰基苯酚，苯甲醚等試劑,。而對于Wang，Rink-Amide,，Trt樹脂,，一般采用TFA切割，切割過程中加入,，乙二硫醇,，苯甲硫醚，水,，三異丙基硅烷,，苯酚等。這些添加試劑主要作為碳正離子俘獲試劑使用,，目的是俘獲切割反應(yīng)過程中生成的碳正離子,，減少這些碳正離子對部分氨基酸側(cè)鏈的進(jìn)攻導(dǎo)致的副反應(yīng)，比較容易產(chǎn)生副反應(yīng)的氨基酸有：Trp,，Tyr,。切割試劑用量一般10-15ml/g樹脂。常用的切割配比：HF/p-cresol/p-thiocresol（90/5/5）,，TFA/TIS/EDT/H2O（94/1/2.5/2.5）,，反應(yīng)一般是在室溫條件下2h-4h。

1.3.3．多肽合成中主要問題

1.3.3.1．消旋及其反應(yīng)機(jī)理

多肽合成過程中,，部分氨基酸在活化的過程中會導(dǎo)致不同程度的消旋,，特別容易消旋的氨基酸有：Cys，His,，Phe,，當(dāng)然這些消旋化還和溶劑，溫度以及多肽合成中的有機(jī)堿等因素有關(guān),。對于這些氨基酸,，可以通過采用高效縮合試劑，減少反應(yīng)時間,，可以減少消旋的比例,，一般條件選擇適當(dāng)，消旋化都可以控制在5%以內(nèi),。消旋反應(yīng)機(jī)理如下：

圖8 消旋反應(yīng)機(jī)理

1.3.3.2．二酮  （DKP）反應(yīng)

DKP副反應(yīng)出現(xiàn)在FMOC-Wang樹脂合成過程中,，主要出現(xiàn)在  個氨基酸為Pro的時候，當(dāng)?shù)诙€氨基酸脫FMOC的時候,，α-氨基被游離出來之后,，立即對Wang樹脂的芐酯鍵進(jìn)行分子內(nèi)胺解,，生成六元環(huán)二酮 衍生物，同時從Wang樹脂上釋放出來,，導(dǎo)致反應(yīng)終止,。該反應(yīng)非常迅速，文獻(xiàn)報道采用50%Pip/DMF,，脫1min,，4min的條件，但是我們實驗證明在多數(shù)情況下,，即使是1min左右反應(yīng)就超過了20%,。因此一般在末端  個氨基酸為Pro的時候，建議采用2-Cl-Trt樹脂合成,，由于該樹脂巨大的空間阻力,，可以*消除該副反應(yīng)。這個副反應(yīng)在BOC策略合成過程中,，卻可以*避免,，因為BOC在使用TFA脫除后，使氨基以TFA鹽的形式存在,，從而失去了親核性,，不能進(jìn)攻芐酯鍵。

圖9  DKP反應(yīng)機(jī)理

1.3.3.3．困難序列多肽合成

固相多肽合成中也經(jīng)常遇到多肽合成失敗或合成效率很低的問題,，這里面的主要原因是由于多肽序列引起的,，因為有些多肽序列在樹脂上形成β-折疊，改變了樹脂的溶脹性能,，還有可能將反應(yīng)的活性位點埋藏在樹脂里面,，這樣使得反應(yīng)很難進(jìn)行，目前報道使用的主要方法有：

使用混合溶劑,，DMSO/DMF,，6N 胍啶/DMF溶液

提高反應(yīng)溫度，或采用微波方法

使用高離液鹽,，LiCl,，NaClO4等。

使用溶脹性能更好的PEG-PS樹脂,，同時減少樹脂擔(dān)載量（0.05-0.2mmol/g）

1.4．合成多肽分析鑒定方法

多肽的分析鑒定方法有多肽一級結(jié)構(gòu),，二級結(jié)構(gòu)鑒定，多肽一級結(jié)構(gòu)包括：質(zhì)譜分析,，氨基酸組成分析,，氨基酸序列分析。二級結(jié)構(gòu)包括：圓二色譜（CD）,，NMR,，X-衍射等方法,。

1.4.1．純度分析

多肽的純度分析，一般都采用HPLC進(jìn)行分析,，選擇RP-C18,，粒徑5μm，孔徑300A,，4.6×150mm,，流動相：A，0.1% TFA/H2O,；B，0.1% TFA/ACN,，洗脫梯度,，5%B--65%B，時間30min,。也有些多肽,，特別是短肽，由于親水性強(qiáng),，在C18上保留很弱,，需要改變條件，這里主要有兩種方法：一個改變分析梯度,，可以將起始梯度改為2%,，等度或小梯度洗脫；另外一個方法是在流動相中加入強(qiáng)離子對試劑,，如七氟丁酸,，十八烷基磺酸鈉等。

1.4.2．一級結(jié)構(gòu)分析

1.4.2.1．質(zhì)譜分析

質(zhì)譜分析的目的主要是確證分子量,，當(dāng)然采用MS/MS可以部分的了解多肽序列的信息,，但是這個需要比較全的數(shù)據(jù)庫作為基礎(chǔ)，分析才能比較準(zhǔn)確,。由于多肽性質(zhì)不穩(wěn)定,，需要采用軟電離技術(shù)，目前多肽分析主要使用了電噴霧（ESI-MS）,，基質(zhì)輔助激光解吸（MALDI-MS）,。其中ESI-MS通常會給出多電荷峰，電荷數(shù)目和多肽序列上氨基,，胍基,，咪唑基的數(shù)目有關(guān)，因此,，經(jīng)常給出了雙電荷,，三電荷等離子峰,。MALDI-MS可以分析蛋白大分子，而且通常情況下很少帶多電荷,，因此數(shù)據(jù)直接對應(yīng)了分子離子峰,，容易分析。此外,，通常在分析長肽或蛋白過程中,，需要添加NH4，Na,，K等離子,，提高靈敏度，所以一般在MS中出現(xiàn)一組峰,，分別對應(yīng)：（M+H）+,，（M+NH4）+，（M+Na）+,，（M+K）+,。

1.4.2.2．氨基酸組成分析

氨基酸組成分析一般需要產(chǎn)品的純度較高，它可以給出多肽中氨基酸的種類,，數(shù)目,。分析過程首先通過酸水解破壞肽鍵，典型酸水解的條件是：真空條件下,，110℃,，用6M鹽酸水解16至72小時。酸水解雖然很有用,，但酸水解條件下不能獲得完整的氨基酸分析,，因為天冬酰胺和谷氨酰胺的側(cè)鏈含有酰胺鍵，用于切斷蛋白質(zhì)肽鍵的酸也可以將天冬酰胺轉(zhuǎn)換為天冬氨酸,，谷氨酰胺轉(zhuǎn)換為谷氨酸,。由于水解溫度比較高，色氨酸的吲哚環(huán)容易被空氣氧化,，即使在密封的管中,，色氨酸的吲哚環(huán)也幾乎都被破壞了。因此蛋白質(zhì)的色氨酸含量往往是通過它的紫外吸收光譜估計的,，也可以通過堿水解分析色氨酸的含量,。半胱氨酸在酸水解中也不能  測定，要  測量需要在蛋白質(zhì)水解之前進(jìn)行氧化或羧甲基化,，形成的衍生物在酸水解之后才能定量,。

1.4.2.3．氨基酸序列分析

氨基酸序列分析的基本原理是Edman降解，主要涉及耦聯(lián)、水解,、萃取和轉(zhuǎn)換等4個過程,。首先使用苯異硫氰酸酯（PITC）在pH9.0的堿性條件下對蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行處理，PITC與肽鏈的N-端的氨基酸殘基反應(yīng),，形成苯氨基硫甲酰（PTC）衍生物,，即PTC-肽。然后PTC-肽用三  處理,，N-端氨基酸殘基肽鍵被有選擇地切斷,，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下來將該衍生物用有機(jī)溶劑（例如氯丁烷）從反應(yīng)液中萃取出來,，而去掉了一個N-端氨基酸殘基的肽仍留在溶液中,。萃取出來的噻唑啉酮苯胺衍生物不穩(wěn)定，經(jīng)酸作用,，再進(jìn)一步環(huán)化,，形成一個穩(wěn)定的苯乙內(nèi)酰硫脲（PTH）衍生物，即PTH-氨基酸,。留在溶液中的減少了一個氨基酸殘基的肽再重復(fù)進(jìn)行上述反應(yīng)過程,，整個測序過程現(xiàn)在都是通過測序儀自動進(jìn)行,。

1.4.3．二級結(jié)構(gòu)分析

1.4.3.1．圓二色譜（CD）

圓二色譜是一種特殊的吸收譜,，它通過測量蛋白質(zhì)等生物大分子的圓二色光譜，從而得到生物大分子的二級結(jié)構(gòu),，簡單,、快捷，廣泛應(yīng)用在蛋白質(zhì)折疊,，蛋白質(zhì)構(gòu)象研究,，酶動力學(xué)等領(lǐng)域。圓二色譜紫外區(qū)段（190-240nm）,，主要生色團(tuán)是肽鏈,，這一波長范圍的CD譜包含了生物大分子主鏈構(gòu)象的信息。α-螺旋構(gòu)象的CD譜在222nm,、208nm處呈負(fù)峰,，在190nm附近有一正峰。β-折疊構(gòu)象的CD譜,，在217-218nm處有一負(fù)峰,，在195-198nm處有一強(qiáng)的正峰。無規(guī)則卷曲構(gòu)象的CD譜在198nm附近有一負(fù)峰,，在220nm附近有一小而寬的正峰,。

1.4.3.2．核磁共振(NMR)

隨著二維、三維以及四維NMR的應(yīng)用,，分子生物學(xué),、計算機(jī)處理技術(shù)的發(fā)展,，使NMR逐漸成為大分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)分析的主要方法之一。NMR可用于確定氨基酸序列,、分布以及構(gòu)象,。目前，NMR在分析分子中含少于30個氨基酸的小肽時是非常有用的,，分析結(jié)果快速準(zhǔn)確,。

1.4.3.3．X-衍射

X-衍射可獲得有關(guān)化合物晶型的直接信息，而且可以判斷相對與構(gòu)型,。

多肽標(biāo)記及修飾

目前多肽標(biāo)記及修飾的內(nèi)容非常多,，廣泛應(yīng)用在多肽藥物，多肽生物學(xué),，多肽抗體以及多肽試劑的研究中,。目前應(yīng)用廣泛的有：非放射性核素標(biāo)記（C13，H2）,，熒光標(biāo)記（FAM,，F(xiàn)ITC），生物素標(biāo)記,，磷酸化修飾等,。

2.1．非放射性核素標(biāo)記

目前在非放射性核素標(biāo)記中，使用廣泛的仍然是C13,，H2,，因為其使用安全，放射性小?，F(xiàn)在有比較*的非放射性標(biāo)記的氨基酸,，可以按照正常的多肽合成方法將標(biāo)記好的氨基酸直接連接到多肽上。

2.2．熒光標(biāo)記

熒光標(biāo)記由于沒有放射性,，實驗操作簡單,。因此，目前在生物學(xué)研究中熒光標(biāo)記應(yīng)用非常廣泛,，熒光標(biāo)記方法與熒光試劑的結(jié)構(gòu)有關(guān)系,，對于有游離羧基的采用的方法與接肽反應(yīng)相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法連接,。但是對于FITC標(biāo)記,，需要在連接FITC前，增加一個氨基己酸,，避免在切割的過程中被TFA切割掉,。

2.3．生物素標(biāo)記

生物素-親合素系統(tǒng) (biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期應(yīng)用于免疫學(xué),，并得到迅速發(fā)展的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng),。由于它具有生物素與親合素之間高度親和力及多級放大效應(yīng)，并與熒光素,、酶,、同位素等免疫標(biāo)記技術(shù)有機(jī)地結(jié)合，使各種示蹤免疫分析的特異性和靈敏度進(jìn)一步提高,。主要有用于標(biāo)記多肽氨基的生物素N-羥基丁二酰亞胺酯(BNHS)和生物素對硝基酚酯(pBNP),，其中以BNHS  ，當(dāng)然,，也可以直接使用生物素也可以標(biāo)記,，因為其結(jié)構(gòu)上有個游離的羧基，采用HBTU/HOBt/DIEA方法縮合,，由于生物素的溶解度低,，使用DMSO/DMF的混合溶劑增加溶解度。

2.4．磷酸肽合成

磷酸肽在生命過程中發(fā)揮重要作用,，磷酸化的位置在多肽上的Ser,，Thr，Tyr,。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸,，目前使用的都是單芐基磷酸化氨基酸，Tyr也可以直接使用磷酸化氨基酸,。磷酸化氨基酸的連接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法,，但是目前采用該方法合成磷酸化也有缺點,，特別是在合成多磷酸化多肽或長肽的時候,，連接效率低，后產(chǎn)品純度很低,，對于這種磷酸化多肽,，我們考慮采用后磷酸化方法，其合成過程就是在多肽合成結(jié)束后,，選擇性脫去要標(biāo)記的氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基,，對于Tyr，Thr可以直接使用側(cè)鏈不保護(hù)的氨基酸進(jìn)行反應(yīng),，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt）,，在1% TFA/DCM條件下可以定量的脫除。后磷酸化,，采用雙芐基亞磷酰胺,，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，隨后在過氧酸下氧化生成磷?；?，完成反應(yīng)。

蛋白結(jié)構(gòu)與功能模擬多肽

多肽在與蛋白受體結(jié)合發(fā)揮功能的時候,，總是先折疊出某些特殊的結(jié)構(gòu),，多肽類似物合成主要是為了模擬這些結(jié)構(gòu)，保持或提高生物活性,，同時也為了改變多肽的穩(wěn)定性,，提高其抗酶解能力。

3.1．α-螺旋多肽

α-螺旋是蛋白結(jié)構(gòu)中  普通的一種,，但是一般多肽在溶液中大多是無規(guī)卷曲的,，目前使用多的方法是多肽保持α-螺旋結(jié)構(gòu)就是在多肽表面通過共價鍵將處在α-螺旋結(jié)構(gòu)的兩個氨基酸連接起來，選擇的位點（i,，i+4或i,，i+7），選擇的化學(xué)鍵包括：二硫鍵,，硫醚鍵,，酰胺鍵，烯烴鍵（RCM）等方法,。

3.1.1．二硫鍵

二硫鍵廣泛存在與蛋白結(jié)構(gòu)中,，對穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)具有非常重要的意義，二硫鍵一般是通過序列中的2個Cys的巰基,，經(jīng)氧化形成,。形成二硫鍵的方法很多：空氣氧化法，DMSO氧化法,，過氧化氫氧化法等,。二硫鍵的合成過程，可以通過Ellman檢測以及HPLC檢測方法對其反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測,。

3.1.2．硫醚鍵

硫醚鍵的形成可以通過序列中的Lys,，將溴乙酸連接到Lys的側(cè)鏈氨基上，利用其和巰基的特異性反應(yīng),，反應(yīng)在緩沖溶液中進(jìn)行,，迅速高效。

3.1.3．酰胺鍵

多肽的內(nèi)酰胺環(huán)肽的合成一般是利用Lys,，Asp（Glu）的選擇性保護(hù),，在固相上直接環(huán)化。BOC策略中可以采用BOC-Lys（Fmoc）,，BOC-Asp（OFm）,，F(xiàn)MOC策略中可以采用FMOC-Lys（Aloc）,，F(xiàn)MOC-Asp（Allyl）。對于首尾環(huán)肽,，還可以先合成保護(hù)的多肽,，然后在液相中環(huán)化生成目標(biāo)多肽。

3.1.4．烯烴鍵（RCM）

RCM反應(yīng)是一個過渡金屬催化反應(yīng),，其反應(yīng)中使用催化劑：(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh,，可以催化烯烴環(huán)化，過程中脫去一分子乙烯,。

圖10  固相RCM反應(yīng)

該反應(yīng)也可以在固相樹脂上直接環(huán)化,反應(yīng)條件：15-25% (Cy3P)2Cl2Ru=CHPh DCM,60-80℃,，24-48h。

3.2．TASP（template-assembled synthetic peptide）多肽

瑞士Basel大學(xué)的化學(xué)家*提出TASP的概念,，他們利用具有“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)的肽鏈作為模板,，然后將具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的多肽直接連接到模板上，模擬蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu),。

3.3．長肽或蛋白合成

3.3.1．FMOC-tbu片段縮合方法

FMOC-tbu片段縮合方法在合成長肽以及蛋白上面運用非常廣泛,，其合成過程首先是合成保護(hù)性肽片段，經(jīng)過純化后,，將幾個片段在液相或固相上組裝起來,。使用本方法主要注意幾個方面：片段的選擇，片段的合成與純化,，片段縮合方法,。片段選擇要考慮到片段連接反應(yīng)時間長，容易導(dǎo)致消旋,，故片段的C末端  選擇Gly,，Pro。合成的片段一般需要經(jīng)過C4,，C8等純化,，對于溶解性很差的多肽，可以采用硅膠柱層析方法進(jìn)行純化,。由于片段的分子大,，在樹脂內(nèi)移動速度慢,，故反應(yīng)時間一般都很長,，而且反應(yīng)過程中與片段濃度關(guān)系很大，溶解的時候,，盡量提高片段的濃度,。對多種條件的選擇，發(fā)現(xiàn)采用DMF為溶劑,，DIC/HOBt的方法縮合效率  ,，消旋也小,。

圖11 FMOC-tbu片段縮合示意圖

3.3.2．自然化學(xué)連接（Native Chemical Ligation）

自然化學(xué)連接方法的優(yōu)點是可以采用*脫保護(hù)的多肽，因此不存在溶解性問題,，其反應(yīng)也是在緩沖水溶液中進(jìn)行,，由于其利用的是巰基和硫酯的特異性反應(yīng)，再經(jīng)過由S到N的轉(zhuǎn)變完成肽鍵的合成,。

圖13自然化學(xué)連接

總之,，今后多肽化學(xué)的研究，不僅是將更多的有機(jī)化學(xué)合成新方法,，新技術(shù)引入到多肽研究當(dāng)中,，而且對蛋白的結(jié)構(gòu)以及功能模擬，開展結(jié)構(gòu)活性研究（structure activity relationship）將是研究開發(fā)的熱點,，因為這將為揭示蛋白的內(nèi)在的生物活性本質(zhì)提供大量實驗數(shù)據(jù),。

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