多肽抗原免疫

動物選擇

要生成好的抗體,，必須選擇與抗原源差異較大的動物,。要想獲得大的免疫反應，不能讓免疫動物對抗原產(chǎn)生‘自體識別’,。例如,，要想生成抗人體蛋白的抗體，使用兔或老鼠比使用猴子要好,。對于非常保守的哺乳動物蛋白,，使用鳥類動物（如雞）效果較好。

動物免疫

我們通常使用弗氏佐劑（Freunds）與抗原進行混合,。次注射*使用Freunds的免疫輔助劑,。輔助劑與抗原聯(lián)合使用，可以提高免疫反應，從而用較少的疫苗可以產(chǎn)生較強的免疫反應,。佐劑可以使抗原緩慢釋放,，從而產(chǎn)生持續(xù)性刺激。注射方式為多位點的皮下注射,。每只注射動物都要先收集免疫前血樣,，以用于和以后的免疫血樣比較。所采集的血清樣本含有不同的免疫型和亞型,。

抗原準備－交聯(lián)方法

化學合成的多肽抗原是小分子,， 本身很難具有好的抗原性，只能誘導動物產(chǎn)生很弱的免疫反應,，因而與載體蛋白交聯(lián)是很重要的,。載體蛋白含有很多抗原決定基，能夠刺激T－幫助細胞,，進而誘導 B－細胞反應,。用于與多肽交聯(lián)的載體蛋白有多種，其中常用的是keyhole limpet hemacyanin (KLH), 牛血清白蛋白（bovine serum albumin,，BSA）, 卵清蛋白（ovalbumin,，OVA）和牛甲狀腺球蛋白（bovine thyroglobulin，THY),。KLH具有更高的抗原性,，是為常用的多肽交聯(lián)載體。BSA也常用來作為多肽載體,，但由于BSA經(jīng)常被用做檢測試驗的阻斷劑而使得該方法生產(chǎn)的抗體在應用上存在著一定的局限性,。

設計合成性多肽常常被忽略的一個方面是如何將多肽交聯(lián)到載體蛋白上。例如,，N－端序列需要通過C－端氨基酸交聯(lián),，而C－端序列則需要通過N－端氨基酸交聯(lián)。內(nèi)部序列則可以交聯(lián)到任何一端,。內(nèi)部序列交聯(lián)的另一考量則是將非共軛端?；虬被驗樵鞍追肿有蛄兄胁粫袔щ姾傻哪┒?。常用的交聯(lián)方法都是基于自由氨基(alph-氨基 或 Lys),、sufhydryl (Cys)或羧基集團(Asp, Glu, 或 alpha-羧基)的存在。的交聯(lián)方法都應該是通過羧基或氨基端殘基將多肽交聯(lián)到載體蛋白上,。所選序列不能有多個殘基都能參與所選交聯(lián)化學反應,。如果多個反應位點存在，可以考慮將多肽序列縮短,，或者選擇反應位點都位于一端的多肽,。對于內(nèi)部序列通常會使用離所預測抗原位點較遠的一端進行交聯(lián),，這樣可以避免可能的屏蔽問題。

抗體鑒定

檢測抗多肽反應是否發(fā)生的簡單方法就是抗多肽ELISA,。有兩種技術可以將多肽鏈接到ELISA板上,。種方法就是直接將多肽鏈接到盤上。但如果鏈接氨基酸恰好是抗原決定簇的一部分,，則抗體無法和多肽進一步鏈接,，這樣產(chǎn)生假陰性結果的可能性增加。第二種方法則是先將多肽與載體蛋白耦合,，然后將多肽－蛋白 耦合體鏈接到ELISA盤上,。這種鏈接方法會使抗體－多肽的結合成功率提高，因為多肽不是直接嵌入盤膜,，因而會更加暴露給抗體,。這種方法因而更可靠，可重復性更高,。需要注意的是,，用于該方法的載體蛋白必須不同于用于免疫耦合的載體蛋白。這樣會避免血清中抗載體蛋白反應所導致的高背景反應,。

當做血清檢測時,，另一點需要記住的是，由于免疫多肽與自然多肽結構上的差別,，檢測時的抗多肽反應與試劑的抗多肽反應可能是不同的,。任何檢測，尤其是測定滴定量以決定收獲點時,，必須包括針對天然狀態(tài)下蛋白的檢測,。當然可以做針對天然狀態(tài)下蛋白的ELISA；但由于血清在不同檢測體系中表現(xiàn)會不一樣,，因此好在血清被日常使用的體系中進行蛋白識別鑒定,。如果血清將用于免疫沉淀反應，就應該進行針對該反應的檢測,。

多肽的序列的設計

多肽是用來模擬蛋白的，為了模仿蛋白的表現(xiàn),，我們需要合成與蛋白有相似的結構和電荷的多肽 ,。當一條肽段從一個蛋白中“切出”之后，兩端的電荷數(shù)將與基因體蛋白有差異,。我們需要改變合成策略來使他們一致,。

總體而言：

如果是出自蛋白C端的序列，通過乙?；瘜端屏蔽,；

如果是出自蛋白N端的序列,，通過酰胺化將C端屏蔽；

如果是出自蛋白中間部分,，用乙?；王０坊瘜啥硕计帘?/span>

多肽純度的定義

多肽的純度通常是通過HPLC，用每分鐘1%的標準乙腈梯度來檢測決定的,。合成過程中,，氨基酸之間的交聯(lián)效率不是總能達到*，因而產(chǎn)生一系列的氨基酸缺失的雜質(zhì),。大多數(shù)這樣的氨基酸缺失的雜質(zhì)在純化過程中都被去掉了,，但有少數(shù)的雜質(zhì)其色譜表現(xiàn)與目標多肽很相近。這些氨基酸缺失的雜質(zhì)肽留在了多肽樣品中就構成了余下的幾個百分點,。

多肽的凈含量

干品多肽的重量中不僅僅包含多肽,，還包含有一些非肽的組份，如水,，被吸收的溶劑,、配位離子和鹽等。 肽的凈含量是指肽在其中的重量百分比,，這個百分比的數(shù)值范圍很大,，可能從50%到90%，取決于純度,、序列以及合成和純化的方法,，不要將肽的凈含量和肽的純度混為一談， 它們是*不同的兩個概念,。純度通常是由HPLC決定的,。純度定義的是多肽樣品中含正確序列的組分的百分比， 而肽的凈含量是指樣品中肽類物質(zhì)相對于總物質(zhì)所占的百分比,，肽的凈含量通常是用氨基酸組分分析或紫外分光法測定的,。這個信息主要是在一些對肽的濃度很敏感的實驗中，對計算肽的濃度是很重要的,。

MAP的應用

MAP是復合抗原多肽,，是將線型多肽的C端連接在多聚Lys核心上形成的分枝多肽，從而增大了整個分子的大小,。雖然MAP減少了多肽與KLH交聯(lián)的步驟,，然而由于MAP多肽的構象活動空間有限，通過它產(chǎn)生的抗體與通過KLH交聯(lián)法產(chǎn)生的抗體相比常常不能被蛋白識別,。再者,，做MAP時沒有自由的肽產(chǎn)生，因而很難除去對多聚Lys核心部分產(chǎn)生的抗體,。HPLC純化MAP很困難,。而且由于MAP分子的不均一性和很大的分子大小,，也不能提供質(zhì)譜鑒定。

抗原多肽交聯(lián)中常見問題

1,、多肽與載體蛋白交聯(lián)

對在動物體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應而言,，大多數(shù)多肽的分子量都太小。將多肽與載體蛋白如KLH等交聯(lián)之后,，不僅能增加抗原的大小,，也能增強免疫性。我們可以提供與KLH和BSA兩種蛋白的交聯(lián),。大多數(shù)客戶選擇與KLH交聯(lián),，因為KLH的免疫性更好，而且BSA在很多實驗中作為Blocking試劑,，由于動物體內(nèi)既會產(chǎn)生對多肽的抗體也會產(chǎn)生對載體蛋白的抗體,，這樣會出現(xiàn)假陽性。

2,、抗體的使用

由于抗體與很多生物分子,，以蛋白和多肽等尤為顯著，有很強的結合能力,，抗體在生物醫(yī)學研究中占據(jù)*的重要地位,，在對蛋白的特性、含量的測定,、分布情況的分析和蛋白的確證等方面都需要用到抗體,。例如：診斷試劑盒如早孕試劑盒等，蛋白microalloy,、immunohistochemistry 和普通的ELISA實驗等,。由于抗體有對特定分子很強的結合能力的特點，用抗體進行體內(nèi)治療成了許多努力的方向,。成功的范例包括Genetech的Herceptin,用于治療一類特殊的乳腺癌和IDEC藥業(yè)公司的Ritaxan,，用于特定類型的Non-Hodgkin`s Lymphomas B-細胞。

3,、抗原和識別區(qū)域：

大多數(shù)情況下,，antigen和immunogen兩個字是可以互換使用的，它們的差別是很小的,。他們是分別指一個分子與免疫系統(tǒng)之間的兩種類型的相互作用,。一個immunogen是指能使一個生物組織的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應的分子，而一個antigen是指能與這種免疫反應的產(chǎn)物結合的分子,，所以immunogen一定是antigen，但antigen不一定是immunogen,，我們這里通用antigen,，特指能與免疫反應的產(chǎn)物—抗體結合的分子,。

識別區(qū)域（epitopes）是指一個抗原分子中一個與抗體直接結合的一段特定的序列，對于任何抗原（抗原蛋白）,，很有可能有多個抗體識別區(qū)域,，對生產(chǎn)抗體而言，易于抗體識別的部位的識別區(qū)域為理想,。

4,、進行KLH交聯(lián)的化學方法

我們用MBS活化KLH，這樣能將載體蛋白（KLH）上面的自由-SH與多肽末端的Cys的側鏈-SH連接起來,，這種方法直接,，特異性高，而且穩(wěn)定,，通常選擇對免疫不重要的一端進行交聯(lián),。

EDC活化載體上的-COOH，將載體的-COOH和多肽的-NH2連接起來也是一種可行的方法,。但我們只建議在多肽序列中有多個Cys時采用該方法,。如果肽鏈中含有多個-COOH或-NH2基因，不建議使用該方法,，因為會造成多重點交聯(lián)的情況,，使多肽結構受影響。常用載體蛋白除KLH外,，還有BSA,，Ovalbumin等，造成KLH的優(yōu)勢是它不干擾ELISA或Western Blot等實驗,。

5,、對抗原多肽交聯(lián)合適的肽鏈長度

通常建議10-15個殘基進行交聯(lián)。肽鏈越長,，抗體識別的區(qū)域越多,，但也就越多機會形成穩(wěn)定的二級結構。就不再是天然的形式了,。太短的肽通常是沒有用的,，除非有充足的理由，如與相關家族蛋白或其他蛋白有序列同源性等,。

6,、KLH交聯(lián)多肽溶液呈乳狀的原因

KLH是一個很大的并且聚合的蛋白。因為它的結構和大小,，它在水中的溶解度是很有限的,，因此是乳狀，這并不影響它的免疫性,，這種混濁的溶液可以直接免疫動物,。

7,、抗體的產(chǎn)量

抗體的產(chǎn)量取決于很多因素：識別區(qū)域的選擇，多肽的合成,，載體的交聯(lián),，免疫的操作步驟和動物的生理系統(tǒng)等等，因此抗體的產(chǎn)量是不等的,。5-25mg都屬于正常范圍,。

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