Tunel檢測病理實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原理

晚期凋亡細(xì)胞中染色體DNA雙鏈或單鏈斷裂產(chǎn)生粘性3'-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)的催化下,，將帶有熒光素分子的dUTP標(biāo)記到DNA的3'-末端,，然后通過熒光顯微鏡觀察、或進(jìn)而用帶有HRP的一抗染色后DAB顯色,，可以進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測,，該實(shí)驗(yàn)稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。

Tunel檢測可以標(biāo)記組織細(xì)胞中發(fā)生凋亡的細(xì)胞,，通過核復(fù)染計(jì)數(shù)細(xì)胞比例,，可以計(jì)算一定組織細(xì)胞中發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例，常用在各方向生物學(xué)研究中凋亡發(fā)生的檢測以及定性比較,。

實(shí)驗(yàn)流程

石蠟切片/冰凍切片/細(xì)胞爬片-脫蠟-通透-酶標(biāo)記反應(yīng)-HRP抗體,DAB顯色,，可白光拍照-核復(fù)染-觀察拍照。

實(shí)驗(yàn)方法

對于貼壁細(xì)胞或細(xì)胞涂片

a. PBS或HBSS洗滌一次,。

b. 如果細(xì)胞貼得不牢,，可以干燥樣品使細(xì)胞貼得更牢。

c. 用4%多聚甲醛或碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液(P0098)固定細(xì)胞30-60分鐘,。

d. 用PBS或HBSS洗滌一次,。

e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分鐘,。

f. 轉(zhuǎn)步驟5,。

對于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液

a. 收集細(xì)胞(不超過200萬細(xì)胞)，PBS或HBSS洗滌一次,。

b. 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘,。為防止細(xì)胞聚集成團(tuán)，宜在側(cè)擺搖床或水

平搖床上緩慢搖動的同時(shí)進(jìn)行固定,。

c. 用PBS或HBSS洗滌一次,。

d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重懸細(xì)胞，冰浴孵育2分鐘,。

e. 轉(zhuǎn)步驟5,。

對于石蠟切片

a. 二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯,，再脫蠟5-10分鐘,。無水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘,。70%乙醇2分鐘,，蒸餾水2分鐘,。

b.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K,，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的作用溫度和時(shí)間需自行摸索),。

c. PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈,，否則會嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng),。

d. 轉(zhuǎn)步驟5。

對于冷凍切片

a. 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘,。

b. PBS或HBSS洗滌2次,，每次10分鐘。

c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS,，冰浴孵育2分鐘,。

d. 轉(zhuǎn)步驟5。

對于貼壁細(xì)胞,、細(xì)胞涂片或組織切片

a. 用PBS或HBSS洗滌2次,。

b. 在樣品上加50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘,。注意：孵育時(shí)需注意在周圍用浸足水的紙或藥棉等保持濕潤,，以盡量減少TUNEL檢測液的蒸發(fā)。

c. PBS或HBSS洗滌3次,。

d. 用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察,。可以使用的激發(fā)波長范圍為450-500nm,，發(fā)射波長范圍為515-565nm(綠色熒光),。

對于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液

a. 用PBS或HBSS洗滌2次。

b. 加入50μl TUNEL檢測液,，37℃避光孵育60分鐘,。

c. PBS或HBSS洗滌2次。

d. 用250-500μl PBS或HBSS懸浮,。

e. 此時(shí)可以用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測或涂片后在熒光顯微鏡下觀察,。可以使用的激發(fā)波長范圍為450-500nm,，發(fā)射波長范

圍為515-565nm(綠色熒光),。

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