毒理學，傷口修復,，皮膚癌,，對紫外線輻射的反應，牛皮癬,，濕疹,，病毒感染，基因傳遞系統(tǒng),，細胞分化,，化妝品研究/測試

1. 從冰箱中獲取一個角質(zhì)形成細胞生長試劑盒; 確保所有組件的蓋子都很緊。
2. 在將生長試劑盒的組分添加到基礎培養(yǎng)基之前解凍它們的組分,。必須在37℃水浴中加熱L-谷氨酰胺組分并在加入基礎培養(yǎng)基之前搖動以溶解任何沉淀物,。
3. 從冷藏中獲取一瓶真皮細胞基礎培養(yǎng)基（485mL）。
4. 通過噴灑70％乙醇,，對所有生長試劑盒組分小瓶和基礎培養(yǎng)基瓶的外表面進行凈化,。
5. 使用無菌技術(shù)并在層流罩或生物安全柜中工作,，如表1所示，將體積的每個生長試劑盒組件轉(zhuǎn)移到基礎培養(yǎng)基瓶中,，每次轉(zhuǎn)移使用單獨的無菌移液管,。
6. 緊緊蓋住完整生長培養(yǎng)基瓶并輕輕旋轉(zhuǎn)內(nèi)容物以確保均勻溶液。不要用力搖晃以避免起泡,。標記瓶子和日期,。
7. *生長培養(yǎng)基應在2°C至8°C的黑暗中儲存（不要冷凍）。在這些條件下儲存時,，完整的生長培養(yǎng)基可穩(wěn)定30天,。

   表1.角質(zhì)形成細胞生長試劑盒組分 

增殖不需要抗微生物劑和酚紅，但如果需要可以加入,。表2  總結(jié)了要添加到完整生長培養(yǎng)基中的任一組分（GA溶液或PSA溶液）  的*體積  ,。

表2.添加抗微生物劑/抗真菌藥和酚紅（可選）

1. 當培養(yǎng)物達到約70％至80％匯合時，使正常角質(zhì)形成細胞通過,。
2. 在解離前將用于原代細胞的胰蛋白酶-EDTA（ATCC PCS-999-003）和胰蛋白酶中和溶液（ATCC PCS-999-004）溫熱至室溫,。在與細胞一起使用之前將*生長培養(yǎng)基加熱至37℃。
3. 對于每個燒瓶,，小心地吸出用過的培養(yǎng)基而不打擾單層,。
4. 用3至5mL D-PBS（ATCC 30-2200）沖洗細胞層一次以除去殘留的培養(yǎng)基。
5. 向每個燒瓶中加入預熱的胰蛋白酶-EDTA溶液（每25cm 2 1至2mL ）,。
6. 輕輕搖動每個燒瓶以確保胰蛋白酶-EDTA溶液*覆蓋細胞,，然后從單層吸出多余的液體。
7. 在顯微鏡下觀察細胞,。當細胞彼此遠離并向上翻（通常在3到6分鐘內(nèi)）時,，從顯微鏡上取下燒瓶并從幾個側(cè)面輕輕敲打，以促進細胞從燒瓶表面脫離,。
   如果細胞難以分離,，則在37℃下孵育含有細胞和胰蛋白酶-EDTA溶液的每個燒瓶以促進分散。
8. 當大多數(shù)細胞似乎脫落時,，快速向每個燒瓶中加入等體積的胰蛋白酶中和溶液（ATCC PCS-999-004）,。輕輕移液或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)物，確保所有胰蛋白酶-EDTA溶液均已中和,。
9. 將解離的細胞轉(zhuǎn)移到無菌離心管中并放置在一邊,，同時處理培養(yǎng)瓶中的任何剩余細胞。
10. 向組織培養(yǎng)瓶中加入3至5mL D-PBS（ATCC 30-2200）以收集可能遺留下來的任何其他細胞,。
11. 將細胞/ D-PBS懸浮液轉(zhuǎn)移到含有胰蛋白酶-EDTA-解離的細胞的離心管中,。
12. 根據(jù)需要重復步驟10和11，直到從燒瓶中收集所有細胞。
13. 將細胞以150×g離心3至5分鐘,。
14. 從細胞沉淀中吸出中和的解離溶液,，并將細胞重懸于2至8mL新鮮的，預熱的*生長培養(yǎng)基中,。
15. 計數(shù)細胞,，并在每平方厘米2500至5000個細胞的密度接種新培養(yǎng)燒瓶2。
16. 將新接種的燒瓶置于37℃,，5％CO 2培養(yǎng)箱中至少24至48小時,，然后進一步處理細胞。有關進紙的指導,，請參閱維護,。