細(xì)胞內(nèi)黑點(diǎn)：首先需要明確的是,，細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒既不是碎片也不是污染,，是細(xì)胞器及細(xì)胞外分泌泡，屬于細(xì)胞自身的結(jié)構(gòu)及特性,。不同類型的細(xì)胞,，胞內(nèi)顆粒的數(shù)量可能不同。培養(yǎng)條件也會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)顆粒的數(shù)量,。

▲ 細(xì)胞內(nèi)黑色顆粒為自身結(jié)構(gòu)特性

細(xì)胞外黑點(diǎn)：通常為細(xì)胞碎片,、細(xì)胞代謝產(chǎn)物或血清中的磷酸鈣沉淀（此文中統(tǒng)稱為碎片），常常與污染混淆,。

最常見的微生物污染為細(xì)菌,、真菌、支原體污染,。真菌與碎片差別很大,，真菌通常為白色圓球狀或白色菌絲狀，碎片是小黑點(diǎn),，不難區(qū)分,。

▲ 真菌污染的兩種典型特征

而支原體用光學(xué)顯微鏡是看不見的，必須要用PCR等實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行檢測(cè),。在此不做贅述,。

然而，細(xì)菌（特別是球狀細(xì)菌）與碎片卻極為相似,，顯微鏡下呈現(xiàn)為小黑點(diǎn),，分布于細(xì)胞周圍。區(qū)分細(xì)菌和碎片則是此文的重點(diǎn),。

4倍或10倍物鏡觀察，可以初步判斷黑點(diǎn)分布情況,，但看不清形態(tài),，不容易判斷,。所以我們首先要將物鏡調(diào)到20或40倍，再進(jìn)一步觀察黑點(diǎn)的特征,。主要從三個(gè)方面來(lái)判斷：1. 形態(tài)特點(diǎn) 2. 運(yùn)動(dòng)方式 3. 是否增殖,。

● 看形態(tài)

碎片通常是不規(guī)則的，有圓形有多邊形,，大小不一,，分布不均勻。細(xì)菌形態(tài)規(guī)則,，呈桿狀,、球狀或線狀，具有高度重復(fù)性,，分布較為均勻,。

● 看運(yùn)動(dòng)

碎片可分為貼壁或懸浮兩種狀態(tài)：貼壁的碎片不會(huì)自主運(yùn)動(dòng)，而懸浮的細(xì)胞碎片會(huì)隨液體輕微震動(dòng)或緩慢飄動(dòng)（越小的碎片越容易震動(dòng),，震動(dòng)頻率越高）,。

細(xì)胞碎片或分泌物是細(xì)胞在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的，正常培養(yǎng)過程中細(xì)胞代謝和死亡無(wú)可避免,，大多細(xì)胞系都會(huì)有類似情況,，只是不同細(xì)胞系碎片顆粒多少會(huì)有區(qū)別。顆粒會(huì)動(dòng)是基于高中時(shí)期所學(xué)基本物理原理-布朗運(yùn)動(dòng),，根據(jù)其他細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞照片情況,，只要拍攝比較清晰的，都可以看到細(xì)胞外黑色顆粒,這些碎片只要是懸浮在液體里都會(huì)做布朗運(yùn)動(dòng),。JCRB細(xì)胞庫(kù)延時(shí)攝影信息可以更明顯觀測(cè)到碎片位置變化,，是布朗運(yùn)動(dòng)的時(shí)間積累結(jié)果。

▲ 細(xì)胞生長(zhǎng)延時(shí)攝影（來(lái)源：JCRB細(xì)胞庫(kù)）

細(xì)菌不會(huì)貼壁,，無(wú)鞭毛的細(xì)菌不會(huì)運(yùn)動(dòng)；有鞭毛的細(xì)菌會(huì)定向游動(dòng),、原地打轉(zhuǎn),、震動(dòng)，細(xì)菌這幾種運(yùn)動(dòng)方式經(jīng)常是同時(shí)存在的,。細(xì)菌相比于碎片,，運(yùn)動(dòng)速度要快得多，運(yùn)動(dòng)幅度也會(huì)更大,。

▲ 碎片隨著液體輕微震動(dòng)

▲ 細(xì)菌快速運(yùn)動(dòng)

● 看增殖

碎片不會(huì)增殖,，但細(xì)胞逐漸死亡或細(xì)胞密度增大,，碎片都會(huì)逐漸增多。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),，培養(yǎng)基中的血清也會(huì)緩慢析出沉淀,，導(dǎo)致黑點(diǎn)變多。但培養(yǎng)基不會(huì)渾濁,。

現(xiàn)在我們大部分時(shí)候培養(yǎng)細(xì)胞都會(huì)加1%青鏈霉素雙抗（也稱為P/S）預(yù)防細(xì)菌污染,，然而有一些細(xì)菌不在P/S抗菌譜中，一旦落入培養(yǎng)基就會(huì)開始增殖,。

大部分細(xì)菌會(huì)在1-2天內(nèi)爆發(fā)式生長(zhǎng),，導(dǎo)致培養(yǎng)基渾濁，肉眼可見流沙狀物質(zhì),。

也有少數(shù)種類細(xì)菌會(huì)受到雙抗的影響,，增殖速度沒那么快。當(dāng)比較難判斷的時(shí)候,，我們可以使用不含雙抗的培養(yǎng)基過夜培養(yǎng),，觀察黑點(diǎn)的增殖情況。

▲ 細(xì)菌污染導(dǎo)致培養(yǎng)基渾濁

如果通過以上三種方法還是難以判斷,，還有一招——將培養(yǎng)上清涂布細(xì)菌培養(yǎng)平板進(jìn)行驗(yàn)證：取細(xì)胞培養(yǎng)上清,，無(wú)菌環(huán)境下涂布細(xì)菌專用的固體培養(yǎng)基平板，置于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-72h,，觀察是否產(chǎn)生菌落,。此方法更準(zhǔn)確，但要求實(shí)驗(yàn)室有微生物培養(yǎng)設(shè)備和材料,，同學(xué)們可以根據(jù)自己的實(shí)際情況選擇合適的方法,。

▲ LB平板菌檢（左：陽(yáng)性 右：陰性）

總之，面對(duì)細(xì)胞中的小黑點(diǎn),，我們無(wú)需過分恐慌,。只要我們深入了解細(xì)胞碎片與微生物污染的特征，并掌握正確的判斷方法,，便能輕松應(yīng)對(duì),。