Tenascin-X Mediates Flow-Induced Suppression of EndMT and Atherosclerosis

Keywords: atherosclerosis; carotid arteries; endothelium; hemodynamics; inflammation; transforming growth factor beta.

動(dòng)脈粥樣硬化是一種累及大中型動(dòng)脈的慢性,、進(jìn)行性、炎癥性疾病,，最終可導(dǎo)致急性心血管事件,，如心肌梗死和中風(fēng),。層流和擾動(dòng)流會(huì)激活內(nèi)皮細(xì)胞中不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,，分別導(dǎo)致抗動(dòng)脈粥樣硬化表型和致動(dòng)脈粥樣硬化表型,。最近,，體外和體內(nèi)研究表明，暴露于擾動(dòng)流的內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)歷內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT），這通過細(xì)胞間粘附的溶解,、細(xì)胞極性的改變和間充質(zhì)標(biāo)志基因的表達(dá)來促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展,。與擾動(dòng)流相反，單向?qū)恿饕种?EndMT,。TGF-β（轉(zhuǎn)化生長因子β）是驅(qū)動(dòng) EndMT 的核心介質(zhì),，內(nèi)皮 TGF-β 已被證明與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展有關(guān)。然而,，人們對(duì)內(nèi)皮 TGF-β 信號(hào)在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中如何激活以及層流和紊亂血流如何調(diào)節(jié)內(nèi)皮 TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)知之甚少,。

肌腱蛋白X（TN-X，tenascin-X）是 tenascin 家族的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白,，可形成同源三聚體,，并具有多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。缺乏該蛋白會(huì)導(dǎo)致經(jīng)典型艾勒斯-當(dāng)洛綜合征,，即彈性蛋白或膠原蛋白結(jié)構(gòu)異常,，引起皮膚、關(guān)節(jié)和血管的脆弱性增加,。

基于此,，德國普朗克心肺研究所、法蘭克福歌德大學(xué)分子醫(yī)學(xué)中心及中國西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院心血管研究中心的研究團(tuán)隊(duì)于 Circulation Research 期刊在線發(fā)表了題為“Tenascin-X Mediates Flow-Induced Suppression of EndMT and Atherosclerosis”的研究成果,，表明內(nèi)皮細(xì)胞響應(yīng)單向?qū)恿鞅磉_(dá) TN-X,，并通過結(jié)合 TGF-β 抑制內(nèi)皮細(xì)胞中 TGF-β誘導(dǎo)的信號(hào)，從而介導(dǎo)對(duì) EndMT 和動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù),。

首先,，為了鑒定被層流上調(diào)的基因，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞保持在靜態(tài)條件或暴露于單向?qū)恿鳎?span style="font-family: 宋體, SimSun; font-size: 17px;">12 dynes/cm2,，48 h）,，發(fā)現(xiàn) >500個(gè)基因發(fā)生變化，除了流量依賴性表達(dá)基因（如 KLF2 和 KLF4）外,，還發(fā)現(xiàn)其他幾個(gè)基因被強(qiáng)烈上調(diào),，包括編碼細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白 TN-X 的 TNXB (圖1 A）。與靜態(tài)條件下的低表達(dá)相比,，暴露于層流 24 小時(shí)導(dǎo)致其 RNA 和蛋白質(zhì)水平強(qiáng)烈上調(diào)（圖1 B,、C）。雖然單向?qū)恿髟黾恿?TNXB 表達(dá)以及包括 KLF2 和 KLF4 在內(nèi)的其他血流依賴性基因的表達(dá)（圖1 B）,，但誘導(dǎo)炎癥基因（包括 CCL2 和 VCAM1）表達(dá)的振蕩流（4 dynes/cm2,，1 Hz）不會(huì)誘導(dǎo) TNXB 或 KLF2 和 KLF4 的表達(dá)（圖1 D、E）,。

然后,，測(cè)試了幾種機(jī)械感應(yīng)和機(jī)械信號(hào)蛋白,，如 PIEZO1、ERK5,、KLF2 和 KLF4 的敲低是否影響層流誘導(dǎo)的 TNXB 表達(dá),，發(fā)現(xiàn)雖然敲低 PIEZO1、ERK5 和 KLF2 對(duì)層流誘導(dǎo)的 TNXB 上調(diào)沒有影響,，但抑制 KLF4 表達(dá)降低了層流誘導(dǎo)的 TNXB 表達(dá),。進(jìn)一步分析表明，KLF4 與至少 2 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合在流動(dòng)反應(yīng)中增加,，其中一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí),，導(dǎo)致層流誘導(dǎo)的TNXB啟動(dòng)子激活喪失，表明其在介導(dǎo)KLF4-依賴性TNXB 表達(dá)調(diào)控中的關(guān)鍵作用,。以上這些數(shù)據(jù)表明,，層流誘導(dǎo)的 TNXB 表達(dá)是由 KLF4 介導(dǎo)的。

為了測(cè)試層流是否也在體內(nèi)誘導(dǎo) TNXB 表達(dá),，分析了在 Tnxb 啟動(dòng)子控制下表達(dá) β-半乳糖苷酶的小鼠細(xì)胞系,。在主要暴露于單向?qū)恿鞯闹鲃?dòng)脈弓外曲率內(nèi)皮中，β-半乳糖苷酶活性明顯高于血流受干擾的主動(dòng)脈弓內(nèi)曲率內(nèi)皮（圖1 F）,。對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞特異性 TN-X 缺失小鼠進(jìn)行分析,，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中 TN-X 的染色不受 TN-X 內(nèi)皮丟失的影響。在人主動(dòng)脈切片中,，還發(fā)現(xiàn) TNXB 在層流區(qū)域（如降主動(dòng)脈）的內(nèi)皮層中高表達(dá),，而在主動(dòng)脈弓內(nèi)曲率的內(nèi)皮表達(dá)相對(duì)較低（圖1 G、H）,。此外,，人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 TNXB 的表達(dá)與 VCAM1 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖1 G、I）,。這些數(shù)據(jù)表明,，當(dāng)體外和體內(nèi)暴露于單向?qū)恿骷羟袘?yīng)力時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞的 TNXB 表達(dá)強(qiáng)烈增加,。

圖1    層流剪切應(yīng)力誘導(dǎo)內(nèi)皮 TN-X（tenascin-X）的表達(dá),。

為了研究體內(nèi)條件下的內(nèi)皮 TN-X 功能，研究了 EC-Tnxb-KO 小鼠,。兩周后,，觀察到 Vcam1 表達(dá)和內(nèi)皮下 CD68 陽性細(xì)胞的數(shù)量都強(qiáng)烈增加。這些改變不僅在主動(dòng)脈弓的內(nèi)曲率中觀察到,，而且在外曲率中也觀察到,。繼續(xù)進(jìn)行部分頸動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化，發(fā)現(xiàn)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞特異性 TN-X 丟失導(dǎo)致頸動(dòng)脈新內(nèi)膜形成強(qiáng)烈增加,。16 周后,，小鼠的主動(dòng)脈、主動(dòng)脈根部以及頭臂動(dòng)脈中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和進(jìn)展強(qiáng)烈增加,。在暴露于單向?qū)恿鞯膮^(qū)域（如降主動(dòng)脈）和暴露于擾動(dòng)流的區(qū)域（如主動(dòng)脈弓的內(nèi)曲率）中,，都觀察到動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展增加。

接下來,，為了了解缺失 TN-X 的情況下內(nèi)皮炎癥增加的機(jī)制,，分析了暴露于不同流動(dòng)模式的內(nèi)皮細(xì)胞的各種標(biāo)志物。RT-qPCR 顯示 EndMT 標(biāo)志物的表達(dá)增加,，如 fn1,、Notch3、Vim,、Mmp2,、Mmp9、Fsp1,、Acta2,、Zeb1 和 Twist1。這伴隨著 EC-Tnxb-KO 小鼠內(nèi)主動(dòng)脈內(nèi)皮中 Smad2 的磷酸化增加,，這表明在沒有 TN-X 的情況下 TGF-β 信號(hào)增加,。同樣，在人降主動(dòng)脈和主動(dòng)脈弓內(nèi)曲率中也發(fā)現(xiàn) TN-X 表達(dá)與纖連蛋白的表達(dá)和 Smad2 的磷酸化呈負(fù)相關(guān),。

為了測(cè)試缺失 TN-X 的情況下 EndMT 和炎癥標(biāo)志物表達(dá)的增加以及 Smad2 磷酸化的增加是否確實(shí)是由于 TGF-β 活性的增加,，用抗-TGF-β 抗體處理 EC-Tnxb-KO 小鼠。在內(nèi)皮 TN-X 缺失的情況下,，抑制 TGF-β 阻斷了 Smad2 磷酸化增加以及 EndMT 炎癥標(biāo)志物表達(dá)的增加（圖2 A,、C），還強(qiáng)烈減少了小鼠部分頸動(dòng)脈結(jié)扎后新內(nèi)膜的形成（圖2 D,、E）,。此外，LDL（低密度脂蛋白）受體缺陷型小鼠TN-X 缺失的內(nèi)皮細(xì)胞中動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的增加（圖2 F,、G）,。

為了測(cè)試內(nèi)皮 TGF-β 信號(hào)是否導(dǎo)致 EndMT 標(biāo)志物表達(dá)增加，生成TN-X 以及 TGF-β 受體1,、2丟失的小鼠,，發(fā)現(xiàn)在 EC-Tnxb-KO 小鼠中Smad2 磷酸化水平和纖連蛋白表達(dá)的增加降低到對(duì)照水平。此外,，缺乏 LDL 受體的小鼠中觀察到的新內(nèi)膜形成增加,，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞中缺乏 TGF-β 受體 1 和 2 時(shí)也減少。這些數(shù)據(jù)表明,，內(nèi)皮細(xì)胞 TN-X 丟失后,，EndMT 和炎癥是由內(nèi)皮細(xì)胞中 TGF-β 信號(hào)增加引起的,。

圖2    抑制 TGF-β  阻斷 EC-Tnxb-KO 小鼠EndMT 和血管炎癥的發(fā)展。

由于 TN-X 在內(nèi)皮細(xì)胞中的缺失會(huì)引起典型的 TGF-β介導(dǎo)的藥物變化,，這可以通過 TGF-β 的藥理學(xué)抑制來阻斷,，實(shí)驗(yàn)假設(shè) TN-X 抑制 TGF-β 活性或其下游信號(hào)。因此,，研究人員確定了 TN-X 濃度增加對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中 TGF-β 誘導(dǎo)的 Smad2/Smad3 磷酸化的影響,，并發(fā)現(xiàn) TN-X 抑制 TGF-β 的作用（圖3 A）。此外,，層流誘導(dǎo)的 TNXB 表達(dá)伴隨著 TGF-β誘導(dǎo)的 Smad 磷酸化強(qiáng)烈降低,。然而，當(dāng)層流誘導(dǎo)的 TNXB 表達(dá)被小干擾 RNA 介導(dǎo)的敲低阻斷時(shí),，這種效果未被觀察到（圖3 B）,。這表明內(nèi)源性上調(diào)的 TN-X 也能夠在體外抑制 TGF-β。

最后,，為了進(jìn)一步表征 TN-X 對(duì) TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)的影響,，研究了 TGF-β 與固定 TGF-β 受體在TN-X 的 C 端部分（由 5 個(gè) FN （纖連蛋白）III 型樣結(jié)構(gòu)域和纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域組成）缺失或存在的情況下的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)TN-X 以濃度依賴性方式抑制 TGF-β 與其受體的結(jié)合（圖3 C）,。

為了測(cè)試 TN-X 是通過與受體結(jié)合還是與 TGF-β 結(jié)合來阻斷 TGF-β 與其受體之間的相互作用,，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析 TN-X 與 TGF-β 及其受體的相互作用。成熟的 TGF-β 與抗-TN-X 抗體特異性共沉淀,，反之亦然（圖3 D）,，而沒有觀察到 TN-X 與 TGF-β 受體的細(xì)胞外部分共沉淀（圖3 D），而細(xì)胞外部分很容易與 TGF-β 共沉淀,。亞結(jié)構(gòu)域分析顯示,，FBG 結(jié)構(gòu)域（而不是 FN III 型樣結(jié)構(gòu)域）與 TGF-β 相互作用（圖3 E）。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明,，TN-X 通過其 FBG 結(jié)構(gòu)域直接與 TGF-β 相互作用,，從而阻止其與 TGF-β 受體相互作用。

圖3    TN-X 結(jié)合 TGF-β 并作為 TGF-β清除劑發(fā)揮作用,。

TN-X 在保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受 TGF-β誘導(dǎo)的 EndMT 中的流動(dòng)依賴性功能的示意圖,。單向?qū)恿髡T導(dǎo)內(nèi)皮 TNXB 的表達(dá)。同源三聚體 TN-X 通過其 C 端 FBG 結(jié)構(gòu)域與 TGF-β 結(jié)合,，從而阻止 TGF-β 與其在內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合,。

總之，這項(xiàng)研究數(shù)據(jù)將 TN-X 確定為生理剪切應(yīng)力發(fā)揮抗炎和動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)活性的核心效應(yīng)子,，其作用機(jī)制是抑制 TGF-β 活性和 EndMT,。模擬 TN-X 介導(dǎo)的 TGF-β 和 EndMT 抑制可能是干擾慢性炎癥性血管疾病（如動(dòng)脈粥樣硬化）進(jìn)展的新機(jī)制,。

參考文獻(xiàn)：Liang G, Wang S, Shao J, Jin YJ, Xu L, Yan Y, Günther S, Wang L, Offermanns S. Tenascin-X Mediates Flow-Induced Suppression of EndMT and Atherosclerosis. Circ Res. 2022 May 27;130(11):1647-1659. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.320694. Epub 2022 Apr 21. PMID: 35443807.

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