徠卡熒光顯微鏡DM500

徠卡熒光顯微鏡DM500

熒光顯微鏡介紹、原來(lái),、主要事項(xiàng)?。?/span>

熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區(qū)別
熒光顯微鏡
1.照明方式通常為落射[1] 式,，即光源通過(guò)物鏡投射于樣品上,；
2.光源為紫外光，波長(zhǎng)較短,，分辨力高于普通顯微鏡,；
3.有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見(jiàn)光,，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線(xiàn),，用以保護(hù)人眼,。
熒光顯微鏡也是光學(xué)顯微鏡的一種，主要的區(qū)別是二者的激發(fā)波長(zhǎng)不同,。由此決定了熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)和使用方法上的不同,。
熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具。它是由光源,、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成,。是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過(guò)物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀(guān)察標(biāo)本的熒光圖像,。

工作原理

光源

熒光顯微鏡工作原理
多采用200W的超高壓汞燈作光源,，它是用石英玻璃制作，中間呈球形,，內(nèi)充一定數(shù)量的汞,，工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起水銀蒸發(fā),，球內(nèi)氣壓迅速升高,，當(dāng)水銀*蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力,，這一過(guò)程一般約需5～15min,。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過(guò)程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光,，足以激發(fā)各類(lèi)熒光物質(zhì),，因此，為熒光顯微鏡普遍采用,。
超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能,。因此，燈室必須有良好的散熱條件,，工作環(huán)境溫度不宜太高,。
新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時(shí)間后,，則需要高壓?jiǎn)?dòng)（約為15000V）,，啟動(dòng)后，維持工作電壓一般為50～60V,，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命,，在每次使用2h的情況下約為200h,，開(kāi)動(dòng)一次工作時(shí)間愈短，則壽命愈短,，如開(kāi)一次只工作20min,，則壽命降低50%,。因此，使用時(shí)盡量減少啟動(dòng)次數(shù),。燈泡在使用過(guò)程中,，其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動(dòng),。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉,，以免水銀蒸發(fā)不*而損壞電極，一般需要等15min,。由于超高壓汞燈壓力很高,，紫外線(xiàn)強(qiáng)烈，因此燈泡必須置燈室中方可點(diǎn)燃,，以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時(shí)造成操作,。
超高壓汞燈（100W或200W）光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流,、啟動(dòng)幾個(gè)部分,。在燈室上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng)，燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡,，前面安裝有集光透鏡,。
產(chǎn)超高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的進(jìn)口燈泡,，平均壽命在200h以上,，價(jià)格也比較低。
我研制的一種簡(jiǎn)易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置,，體積小,，重量輕，功率小,，交,、直流兩用（自帶直流電源），易于攜帶,，使用方便,，已推廣應(yīng)用。

濾色系統(tǒng)

濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位,，由激發(fā)濾板和壓制濾板組成,。濾板型號(hào)，各廠(chǎng)家名稱(chēng)常不統(tǒng)一,。濾板一般都以基本色調(diào)命名,，前面字母代表色調(diào)，后面字母代表玻璃,，數(shù)字代表型號(hào)特點(diǎn),。如德產(chǎn)品（Schott）BG12,，就是種藍(lán)色玻璃，B是藍(lán)色的*.*/*個(gè)字母,，G是玻璃的*.*/*個(gè)字母,；我產(chǎn)品的名稱(chēng)已統(tǒng)一用拼音字母表示，如相當(dāng)于BG12的藍(lán)色濾板名為QB24,，Q是青色（藍(lán)色）拼音的*.*/*個(gè)字母,，B是玻璃拼音的*.*/*個(gè)字母。不過(guò)有的濾板也可以透光分界濾長(zhǎng)命名,，如K530,，就是表示壓制濾長(zhǎng)530nm以下的光而透過(guò)530nm以上的光。還有的廠(chǎng)家的濾板*以數(shù)字命名,，如美Corning廠(chǎng)的NO：5-58,，即相當(dāng)于BG12,。
1．激發(fā)濾板 根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn),，可選用以下三類(lèi)激發(fā)濾板，提供一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光,。
紫外光激發(fā)濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過(guò),，阻擋400nm以上的可見(jiàn)光通過(guò),。常用型號(hào)為UG-1或UG-5，外加一塊BG-38,，以除去紅色尾波,。
紫外藍(lán)光激發(fā)濾板：此濾板可使300～450nm范圍內(nèi)的光通過(guò)。常用型號(hào)為ZB-2或ZB-3,，外加BG-38,。
紫藍(lán)光激發(fā)濾板：它可使350～490nm的光通過(guò)。常用型號(hào)為QB24（BG12）,。
大吸收峰在500nm以上者的熒光素（如羅達(dá)明色素）可用藍(lán)綠濾板（如B-7）激發(fā),。
開(kāi)始采用屬膜干涉濾板，由于針對(duì)性強(qiáng),，波長(zhǎng)適當(dāng),，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠(chǎng)的FITCKP490濾板和羅達(dá)明的S546綠色濾板,，均遠(yuǎn)比玻璃濾板效果好,。
激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板,，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些,。基本要求是以獲得明亮的熒光和的背景為準(zhǔn)。
2．壓制濾板 壓制濾板的作用是*阻擋激發(fā)光通過(guò),，提供相應(yīng)波長(zhǎng)范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對(duì)應(yīng),，常用以下3種壓制濾板：
紫外光壓制濾板：可通過(guò)可見(jiàn)光,、阻擋紫外光通過(guò)。能與UG-1或UG-5組合,。常用GG-3K430或GG-6K460,。
紫藍(lán)光壓制濾板：能通過(guò)510nm以上波長(zhǎng)的光（綠到紅），能與BG-12組合,。通常用OG-4K510或OG-1K530,。
紫外紫光壓制濾板：能通過(guò)460nm以上波長(zhǎng)的光（藍(lán)到紅），可與BG-3組合,，常用OG-11K470AK 490,，K510。
反光鏡
反光鏡的反光層一般是鍍鋁的,，因?yàn)殇X對(duì)紫外光和可見(jiàn)光的藍(lán)紫區(qū)吸收少,，反射達(dá)90%以上，而銀的反射只有70%,；一般使用平面反光鏡,。

聚光鏡

專(zhuān)為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器和暗視野聚光器兩種,。還有相差熒光聚光器,。
1．明視野聚光器 在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強(qiáng),，使用方便,，特別適于低、中倍放大的標(biāo)本觀(guān)察,。
2．暗視野聚光器 暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛,。因?yàn)榧ぐl(fā)光不直接進(jìn)入物鏡，因而除散射光外,，激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡,，可以使用薄的激發(fā)濾板，增強(qiáng)激發(fā)光的強(qiáng)度,，壓制濾板也可以很薄,，因紫外光激發(fā)時(shí)，可用無(wú)色濾板（不透過(guò)紫外）而仍然產(chǎn)生黑暗的背景,。從而增強(qiáng)了熒光圖像的亮度和反襯度,，提高了圖像的質(zhì)量，觀(guān)察舒適,，可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒,。
3．相差熒光聚光器 相差聚光器與相差物鏡配合使用,，可同時(shí)進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀(guān)察，既能看到熒光圖像,，又能看到相差圖像,，有助于熒光的定位準(zhǔn)確。一般熒光觀(guān)察很少需要這種聚光器,。
物鏡
各種物鏡均可應(yīng)用,，但用消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能（波長(zhǎng)范圍）適合于熒光,。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比,，而與其放大倍數(shù)成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度,，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡,。尤其在高倍放大時(shí)其影響非常明顯。因此對(duì)熒光不夠強(qiáng)的標(biāo)本,，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡,，配合以盡可能低的目鏡（4?,5?，6.3?等）,。
目鏡
在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡,，如5?和6.3?。過(guò)去多用單筒目鏡,，因?yàn)槠淞炼缺入p筒目鏡高一倍以上,，但研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀(guān)察很方便,。
落射光裝置
新型的落射光裝置是從光源來(lái)的光射到干涉分光濾鏡后,，波長(zhǎng)短的部分（紫外和紫藍(lán)）由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射，當(dāng)濾鏡對(duì)向光源呈45,。傾斜時(shí),，則垂直射向物鏡，經(jīng)物鏡射向標(biāo)本,，使標(biāo)本受到激發(fā),，這時(shí)物鏡直接起聚光器的作用。同時(shí),，濾長(zhǎng)長(zhǎng)的部分（綠,、黃、紅等）,，對(duì)濾鏡是可透的,，因此，不向物鏡方向反射，濾鏡起了激發(fā)濾板作用,，由于標(biāo)本的熒光處在可見(jiàn)光長(zhǎng)波區(qū),，可透過(guò)濾鏡而到達(dá)目鏡觀(guān)察，熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高,，在高放大時(shí)比透射光源強(qiáng),。它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標(biāo)本,，如厚片、濾膜,、菌落,、組織培養(yǎng)標(biāo)本等的直接觀(guān)察。研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置,，稱(chēng)之為落射熒光顯微鏡,。

CCD簡(jiǎn)介

熒光顯微鏡CCD
熒光顯微CCD是與熒光顯微鏡密切相關(guān)的數(shù)碼攝像產(chǎn)品，一方面它可以將熒光顯微鏡拍攝的顯微攝影產(chǎn)品通過(guò)usb接口傳輸?shù)诫娔X中,，便于圖像的采集研究,，另一方面，通過(guò)熒光顯微鏡CCD我們可以拍攝到比單純使用熒光顯微鏡更好的圖片,。熒光顯微鏡CCD可以連接熒光顯微鏡組成顯微成像系統(tǒng),。

使用范圍

一般情況下，單使用熒光顯微鏡即可以達(dá)到我們想要的成像效果,，但在某些情況下,，比如說(shuō)當(dāng)熒光比較微弱的情況下，僅僅通過(guò)熒光顯微鏡并不能達(dá)到理想的拍攝效果,，或者我們希望可以將拍攝的熒光圖片上傳的電腦生面預(yù)覽,，修改甚發(fā)表學(xué)術(shù)論文，這時(shí)候沒(méi)有熒光顯微鏡CCD是不能達(dá)到要求的,。產(chǎn)品特點(diǎn)
熒光顯微鏡CCD一般具有良好的弱光捕捉能力,，能夠捕捉到極其微弱的熒光，因此成像能力好,，此外,，很多熒光冷CCD上搜對(duì)此類(lèi)CCD作了制冷處理，使得此類(lèi)CCD的噪音大大降低,，信噪比得以很大的提高,。由于其方便應(yīng)用效果，此類(lèi)CCD相機(jī)被廣泛應(yīng)用于熒光顯微鏡,。
標(biāo)本制作要求
熒光顯微鏡的標(biāo)本制作要求
1,、載玻片
載玻片厚度應(yīng)在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片， 一方面光吸收多,，另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集,。載玻片必須光潔，厚度均勻,，無(wú)明顯自發(fā)熒光,。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。
2,、蓋玻片
蓋玻片厚度在0.17mm左右,，光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光 ,，也可用于涉蓋玻片,，這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長(zhǎng)的光起到不同干涉作用的物質(zhì)（如氟化鎂）的蓋玻片，它可以使熒光順利通過(guò),，而反射激發(fā)光,，這種反射的激發(fā)光可激發(fā)標(biāo)本。
3,、標(biāo)本
組織切片或其他標(biāo)本不能太厚,，若太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀(guān)察到的上部不充分激發(fā),。另外,，細(xì)胞重疊或雜質(zhì)掩蓋，影響判斷,。
4,、封裱劑
封裱劑常用甘油，必須無(wú)自發(fā)熒光,，無(wú)色透明,，熒光的亮度在pH8.5～9.5時(shí)較亮，不易很快褪去 ,。所以,，常
5、鏡油
一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀(guān)察標(biāo)本時(shí),，必須使用鏡油,，使用特制的無(wú)熒光鏡油，也可用上述甘油代替,，液體石蠟也可用,，只是折光率較低，對(duì)圖像質(zhì)量略有影響,。
使用方法
（1）打開(kāi)燈源,，超高壓汞燈要預(yù)熱15min才能達(dá)到亮點(diǎn),。
（2）透射式熒光顯微鏡需在光源與暗視野聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的壓制濾片,。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片,、雙色束分離器、壓制濾片的插塊,。
（3）用低倍鏡觀(guān)察,，根據(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心,，使其位于整個(gè)照明光斑的*,。
（4）放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀(guān)察,。使用中應(yīng)注意：未裝濾光片不要用眼直接觀(guān)察,，以免引起眼的損傷；用油鏡觀(guān)察標(biāo)本時(shí),，必須用無(wú)熒光的特殊鏡油；高壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開(kāi),，需待汞燈*冷卻后才能再啟動(dòng),，否則會(huì)不穩(wěn)定，影響汞燈壽命,。
（5）觀(guān)察,。例如：在熒光顯微鏡下用藍(lán)紫光濾光片，觀(guān)察到經(jīng)0.01%吖啶橙熒光染料染色的細(xì)胞,，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色),。
注意事項(xiàng)
（1）嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠(chǎng)說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序,。
（2）應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查,。進(jìn)入暗室后，接上電源,，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min,，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛*適應(yīng)暗室,，再開(kāi)始觀(guān)察標(biāo)本,。
（3）防止紫外線(xiàn)對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡,。
（4）檢查時(shí)間每次以1～2h為宜,，超過(guò)90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降,，熒光減弱,；標(biāo)本受紫外線(xiàn)照射3～5min后,，熒光也明顯減弱；所以,，多不得超過(guò)2～3h,。
（5）熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查,，以節(jié)省時(shí)間,，保護(hù)光源。天熱時(shí),，應(yīng)加電扇散熱降溫,，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí),，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃,。中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。
（6）標(biāo)本染色后立即觀(guān)察,，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱,。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間,，防止封裱劑蒸發(fā),。長(zhǎng)時(shí)間的激發(fā)光照射標(biāo)本，會(huì)使得熒光衰減和消失現(xiàn)象,，故應(yīng)盡可能縮短照射時(shí)間,。暫時(shí)不觀(guān)察時(shí)可用擋光板遮蓋激發(fā)光。
（7）標(biāo)本觀(guān)察時(shí)候應(yīng)采用無(wú)熒光油,，應(yīng)避免眼睛直視紫外光源,。
（8）電源應(yīng)安裝穩(wěn)壓器，電壓不穩(wěn)會(huì)降低熒光燈的壽命,。[2] 
熒光顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的區(qū)別
熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區(qū)別：
1.照明方式通常為落射式,，即光源通過(guò)物鏡投射于樣品上；
2.光源為紫外光,，波長(zhǎng)較短,，分辨力高于普通顯微鏡；
3.有兩個(gè)特殊的濾光片,，光源前的用以濾除可見(jiàn)光,，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線(xiàn)，用以保護(hù)人目,。
熒光顯微鏡也是光學(xué)顯微鏡的一種,，主要的區(qū)別是二者的激發(fā)波長(zhǎng)不同。由此決定了熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)和使用方法上的不同,。
熒光顯微鏡是免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具,。它是由光源,、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光,，通過(guò)物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀(guān)察標(biāo)本的熒光圖像,。