徠卡DM3000熒光顯微鏡用于熒光原位雜交（FISH)介紹

徠卡DM3000熒光顯微鏡用于熒光原位雜交（FISH)介紹

技術(shù)：

1,、熒光原位雜交原理

FISH(fluorescence in situ hybridization)技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù),。它的基本原理是:如果被檢測(cè)的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補(bǔ)的,，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性,，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體,。將核酸探針的某一種核苷酸標(biāo)記上報(bào)告分子如生物素、,，可利用該報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng),，經(jīng)熒光檢測(cè)體系在鏡下對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析,。

2,、熒光原位雜交特點(diǎn)

原位雜交的探針按標(biāo)記分子類型分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。用同位素標(biāo)記的放射性探針優(yōu)勢(shì)在于對(duì)制備樣品的要求不高,，可以通過(guò)延長(zhǎng)曝光時(shí)間加強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度,，故較靈敏。缺點(diǎn)是探針不穩(wěn)定,、自顯影時(shí)間長(zhǎng),、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等,。采用熒光標(biāo)記系統(tǒng)則可克服這些不足,，這就是FISH技術(shù)。FISH技術(shù)作為非放射性檢測(cè)體系,，有以下特點(diǎn),。

熒光原位雜交優(yōu)點(diǎn):1、熒光試劑和探針經(jīng)濟(jì),、安全;2,、探針?lè)€(wěn)定，一次標(biāo)記后可在兩年內(nèi)使用;3,、實(shí)驗(yàn)周期短,、能迅速得到結(jié)果、特異性好,、定位準(zhǔn)確;4,、FISH可定位長(zhǎng)度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當(dāng);5,、多色FISH通過(guò)在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列;6,、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu),。

熒光原位雜交缺點(diǎn)：不能達(dá)到100%雜交,，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。

3,、熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)流程

FISH樣本的制備→探針的制備→探針標(biāo)記→雜交→(染色體顯帶)→熒光顯微鏡檢測(cè)→結(jié)果分析,。

4,、熒光原位雜交應(yīng)用

熒光原位雜交技術(shù)不但可用于已知基因或序列的染色體定位，而且也可用于未克隆基因或遺傳標(biāo)記及染色體畸變的研究,。在基因定性,、定量、整合,、表達(dá)等方面的研究中頗具優(yōu)勢(shì),。

熒光原位雜交技術(shù)初用于中期染色體。從正在分化的細(xì)胞核中制備的這種染色體是高度凝縮的,，每條染色體都具有可識(shí)別的形態(tài),，它們?nèi)旧髮@現(xiàn)出特征性的著絲粒位置及染色帶型。在處理中期染色體時(shí),，通過(guò)測(cè)定FISH所獲得熒光信號(hào)相對(duì)于染色體短臂末端的位置(FLpter值)來(lái)進(jìn)行作圖,。使用中期染色體的不足之處在于，由于它的高度凝縮的性質(zhì),，只能進(jìn)行低分辨率作圖,，兩個(gè)標(biāo)記少分隔1Mb才能作為分開的雜交信號(hào)被分辨出來(lái)(Trask et al.，1991),。這種分辨率不足以構(gòu)建有交往的染色體圖譜,。故此中期染色體FISH主要用于確定新標(biāo)記在染色體上的大概位置，為其他更精細(xì)的作圖方法做準(zhǔn)備,。 一直以來(lái),，這些“其他方法”并不包括任一種FISH，但1995年后,，一系列高分辨率的FISH技術(shù)已發(fā)展起來(lái),。這些技術(shù)通過(guò)改變待研究的染色體制備的性質(zhì)而達(dá)到較高的分辨率。中期染色體對(duì)于精細(xì)作圖來(lái)說(shuō)凝縮度太高,，因而我們需要選用較為伸展的染色體,。有兩種途徑可以滿足這一要求(Heiskanen et al.，1996)： 機(jī)械伸展的染色體(mechanically stretched chromosome)通過(guò)改變從中期細(xì)胞核中分享染色體的方法而獲得,。離心產(chǎn)生剪切力可將染色體伸展到正常長(zhǎng)度20倍,。每條染色體仍可識(shí)別，而FISH信號(hào)作圖方法與通常處理的中期染色體相同,，這樣，分辨率可明顯提高,，能夠區(qū)分出相隔200~300kb的標(biāo)記,。 非中期染色體(non-metaphase chromosome)染色體僅在中期高度凝縮，而在細(xì)胞周期的其他階段保持天然未包裝狀態(tài),，有研究者曾利用前期細(xì)胞核,，此時(shí)染色體凝縮程度足以區(qū)分出單個(gè)染色體。實(shí)際應(yīng)用中，這種方法并無(wú)優(yōu)于機(jī)械伸展的染色體之處,。相比之下分裂間期(interphase)的染色體更為有用,，因?yàn)榉至验g期(再次細(xì)胞核分裂之間)的染色體包裝程度低。使用分裂間期的染色體,，分辨率有可能達(dá)到25kb以下,，但染色體形態(tài)特征消失，推動(dòng)了定位探針位置所需的外部參照點(diǎn),。因此,，該技術(shù)可在已獲得染色體粗略圖譜后使用，通常作為確定染色體一段小區(qū)域內(nèi)一系列標(biāo)記物順序的方法,。 間期染色體含有去組裝的全部的細(xì)胞DNA分子,。為了進(jìn)一步提高FISH的分辨率到25kb以下，有必要放棄完整的染色體,，而使用純化的DNA,。這種方法叫做纖維-FISH(fiber-FISH)，利用凝膠拉伸或分子梳理技術(shù)制備DNA,，可以分辨間距小于10kb的標(biāo)記,。