免疫熒光

免疫熒光：用抗原抗體特異性結合原理,，在同一張切片上兩個抗原進行同時標記，從而實現(xiàn)定位,，定性,，半定量的分析。

實驗步驟：

1. 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入環(huán)保型脫蠟液10min-環(huán)保型脫蠟液10min-環(huán)保型脫蠟液10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ5min-蒸餾水洗,。

2. 抗原修復：組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液（PH8.0）的修復盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復,。中火8min停火8min轉(zhuǎn)中低火7min,，此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā),，切勿干片,。自然冷卻后將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。(修復液和修復條件根據(jù)組織來確定）

3. 畫圈：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走）

4. 血清封閉:在圈內(nèi)滴加BSA孵育30min,。（一抗若是山羊來源，則加驢血清）

5. 加第一抗：輕輕甩掉封閉液,，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）

6. 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應種屬標記的按一定比例配好的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min,。

7. DAPI復染細胞核：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,，避光室溫孵育10min。

8. 自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后,，在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5min,，流水沖洗10min。

9. 封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

10. 鏡檢拍照：切片置于掃描儀下采集圖像或熒光顯微鏡下拍照,。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm,，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍光,；FITC激發(fā)波長465-495nm,，發(fā)射波長515-555 nm，發(fā)綠光,；CY3激發(fā)波長510-560,，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光. CY5激發(fā)波長 608-648nm, 發(fā)射波長672-712,。 DAPI染出來的細胞核在紫外的激發(fā)下為藍色，陽性表達為相應熒光素標記的紅光,，綠光 ,。