人皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子(CTACK/CCL27)適用于以下樣本的測試

血清,、血漿–組織勻漿–腹水–細(xì)胞,、培養(yǎng)上清

本試劑盒僅供研究，不用于臨床診斷

一,、實(shí)驗(yàn)原理：
本試劑盒采用競爭法檢測樣本中人皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子(CTACK/CCL27)的含量,。向預(yù)先包被了抗體的酶標(biāo)孔中加入樣本，再加入生物素標(biāo)記的識(shí)別抗原,，在37℃下孵育30min,，兩者與固相抗體競爭結(jié)合形成免疫復(fù)合物，經(jīng)PBST洗滌除去未結(jié)合的生物素抗原,，然后加入親和素-HRP,，在37℃下孵育30min，親和素-HRP與生物素抗原結(jié)合,，洗滌后結(jié)合的HRP催化TMB（四甲基聯(lián)苯胺）成藍(lán)色,，隨后在酸的作用下轉(zhuǎn)化成黃色，在450nm波長下有吸收峰,，吸光值與樣本中抗原的濃度成負(fù)相關(guān)

二,、試劑盒組成：

注：
a、試劑盒中“樣品稀釋液”為0.05M的PBS,，“終止液”為2M的H2SO4,，洗滌液為含0.15%吐溫-20的PBST，如不夠可自行配制,。
b,、不同公司的緩沖體系存在較大差異，請(qǐng)勿將本試劑盒的試劑與其他公司的試劑混用以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。
c,、濃縮洗滌液在低溫下會(huì)有少量鹽類析出，稍微加溫后即會(huì)消失,，不影響使用,。
 

三、試劑盒保存
本試劑盒可以在2-8℃下保存6個(gè)月,，在-20℃下可以保存更長的時(shí)間,。酶標(biāo)板為真空包裝，板條可以拆卸,，拆開以后如一次不能用完,，請(qǐng)放入提供的密封袋中，放入干燥劑,，2-8℃保存,，在一個(gè)月之內(nèi)仍然有效,。試劑不能反復(fù)凍融,。
四,、需要而未提供的試劑和器材
a、37℃恒溫箱,。
b,、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀。
c,、精密移液器及一次性吸頭
d,、雙蒸水或超純水
e、干凈的試管或Eppendof管
f,、吸水紙
g,、自動(dòng)洗板機(jī)或8道排槍
h、ELISA數(shù)據(jù)處理軟件,，推薦使用ELISACalc
i,、500ml燒杯的和適當(dāng)量程的量筒
五、試劑準(zhǔn)備
a,、使用前所有試劑應(yīng)置于室溫平衡至少30分鐘,。
b、本試劑盒可以直接加樣,，如濃度過高,，可以進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋，計(jì)算時(shí)應(yīng)將結(jié)果乘以稀釋的倍數(shù)（建議先做預(yù)實(shí)驗(yàn),，以確定稀釋倍數(shù)）,。
c、洗滌液為25倍濃縮液,，使用前將所有洗滌液倒入500ml或1L的燒杯中,，用雙蒸水定容到500ml即為工作液。
d,、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：先用標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液漿標(biāo)準(zhǔn)品凍干粉定容到150μl,，然后漩渦混勻30秒即為標(biāo)準(zhǔn)品原液(24小時(shí)內(nèi)用完)。取5支干凈的Eppendorf管,，每管加150μl的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液,，分別標(biāo)記上32ng/ml，16ng/ml,，8ng/ml,，4ng/ml，2ng/ml,。取150μl標(biāo)準(zhǔn)品原液加入標(biāo)記32ng/ml 的管中,，混勻后同樣取出150μl，加入下一管,，以此類推直至后一管,。] （見下圖）
零孔：直接加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液,。

原液64ng/ml      32ng/ml     16ng/ml     8ng/ml      4ng/ml      2ng/ml
e、生物素抗原的稀釋：低速離心,，然后抽取生物素抗原稀釋液1ml到濃縮型生物素抗原中,，漩渦混勻15秒，至凍干粉*溶解,，然后將所有液體倒入稀釋液瓶中,，漩渦混勻后即為生物素抗原工作液(一周內(nèi)用完),。
f,、親和素-HRP的稀釋：低速離心,，使?jié)饪s液全部沉到管底,，將濃縮親和素-HRP全部轉(zhuǎn)移到稀釋液瓶中,，漩渦混勻后即為親和素-HRP工作液(一周內(nèi)用完),。
六,、樣本前處理
a,、標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
b,、血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，2000-3000轉(zhuǎn)/分，離心 20分鐘左右,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心,。
c,、血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后,，2000-3000轉(zhuǎn)/分,，離心 20分鐘左右。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。
d,、尿液：用無菌管收集,，2000-3000轉(zhuǎn)/分，離心 20分鐘左右,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行。
e,、細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時(shí),，用無菌管收集。2000-3000轉(zhuǎn)/分,，離心 20分鐘左右,。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用PBS (PH7.2-7.4)稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。2000-3000轉(zhuǎn)/分，離心 20分鐘左右,。仔細(xì)收集上清,。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。
f,、組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。2000-3000轉(zhuǎn)/分,，離心 20分鐘左右。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用。
七,、洗板方法
a,、手工洗板：先洗去酶標(biāo)孔中的的液體，在吸水紙上拍干,，然后每孔加入300μl稀釋好的洗滌液,，輕輕搖晃30秒,，然后甩掉，在吸水紙上拍干,，重復(fù)4-5次,。
b、洗板機(jī)洗板：洗板機(jī)洗板比較便捷,，但應(yīng)操作熟練后使用,。
八、詳細(xì)操作程序
a,、使用前請(qǐng)先將試劑盒在室溫下平衡半小時(shí),。
b、空白孔不加樣,，只加顯色劑A,，B和終止液用于調(diào)零。
c,、標(biāo)準(zhǔn)品孔：每孔加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50μl,，零孔加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣品稀釋液50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl,。
d,、樣品孔：加入樣品50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl,。
e,、輕輕搖晃，蓋上封板膜,，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min,。
f、將25倍濃縮洗滌液用蒸餾水25倍稀釋后備用,。
g,、*次洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干。
h,、加入50μl親和素-HRP到標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中,，輕輕搖晃，蓋上封板膜，37℃培養(yǎng)箱中孵育30min,。
i,、第二次洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次,，拍干。
j,、顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl,，再加入顯色劑B 50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色10分鐘。
k,、終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
l,、測定：以空白孔調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。
m,、計(jì)算：根據(jù)濃度和OD值算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，建議用計(jì)算軟件進(jìn)行計(jì)算,，推薦使用人皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子(CTACK/CCL27)calc進(jìn)行計(jì)算,，擬合模型選用logistic曲線（四參數(shù)）。標(biāo)曲示意圖如下：

九,，操作總結(jié)
準(zhǔn)備試劑,，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品 

加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，生物素抗原,，37℃反應(yīng)30分鐘

洗板5次,，加入親和素-HRP，37℃反應(yīng)30分鐘

洗板5次,，加入顯色液A,、B，37℃顯色10分鐘

加入終止液

10分鐘之內(nèi)讀OD值

計(jì)算
10,、性能參數(shù)
a,、批內(nèi)差：CV＜10%
b、批間差：CV＜12%
c、檢測限：0.2-60ng/ml
d,、保  存：2-8℃
e,、規(guī)  格：96T/盒
f、有效期：6個(gè)月(2-8℃)

11,、問題分析

購買人皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子(CTACK/CCL27)聲明：1,、限于現(xiàn)有條件及科技水平，尚不能對(duì)所有原料進(jìn)行全面分析,，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn),。
2、終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性,、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān),，請(qǐng)務(wù)必準(zhǔn)備充足的待測樣本并預(yù)留備份，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整樣本濃度,。
3,、試驗(yàn)中請(qǐng)穿著實(shí)驗(yàn)服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品時(shí),，請(qǐng)按國家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條例執(zhí)行,。