產(chǎn)品及特點

本產(chǎn)品是根據(jù)本公司的雙染料 RT-LAMP 技術(shù)開發(fā)的熒光和可見光雙模式檢 測試劑盒 ,，它既可以用于熒光 RT-LAMP 擴增及檢測 ,，也可以用于可視化 RT-LAMP 擴增及檢測 ,，適用于各種針對核酸的快速定性檢測,。  本產(chǎn)品具有下列特點：

1.   含可見光和熒光染料，  既可以用金屬浴和水浴擴增用可見光肉眼判斷結(jié)果 ,，也可

用熒光 PCR 儀進行實時熒光檢測,。

2.   內(nèi)含的 dUTP-UNG 可防交叉污染。

3.   特異性比 RT-PCR 高,，  因為 RT-LAMP 擴增使用 4-6 條引物而不是兩條,。

4.   靈敏性可達 10 拷貝/反應以下  (隨引物而不同)  ，故假陰性率更低,。

5.   只可用于科研 ,，只可進行定性檢測 ，不能用于定量檢測,。

自備 RNA 模板

總 RNA

或 poly(A) mRNA

或?qū)Ｒ坏?/span> RNA

注意 ：RNA 樣品不能有基因組 DNA 污染。

100-500 ng

10-500 ng

0.01pg-500ng

鐘在 FAM 通道采集一次熒光信號。

13. 如果使用 PCR 儀,、金屬浴或水浴進行擴增,，再使用 qPCR 儀進行終點法熒光讀數(shù)： 則在擴增前和擴增后，分別在 qPCR 儀器上測熒光讀數(shù)(溫度設(shè)為 60-65 ℃,，  1 次循環(huán),，每次循環(huán) 1 分鐘，在 FAM 通道采集一次熒光信號,。注意：  測熒光讀數(shù)必 須在 65℃進行)  ,。擴增反應按 60-65 ℃ ，90 分鐘進行。

四,、   結(jié)果分析及解讀

14. 如果是用普通 PCR 儀器,、水浴或金屬浴進行的擴增，反應結(jié)束后只能肉眼判斷結(jié) 果,。將反應管放置在白色背景(如白紙) 前觀察,。擴增陽性對照管內(nèi)反應液將呈現(xiàn) 藍色，無模板和無引物的陰性對照將呈淺藍色,。如果擴增陽性對照管內(nèi)反應液不呈 現(xiàn)藍色,，或無模板和無引物的陰性對照任何一個呈現(xiàn)藍色，則說明試劑有問題,， 實 驗無效,。請跟廠家聯(lián)系。

15. 如果實驗有效,，  則分析 N+2 個樣品管的結(jié)果,。如果樣品管反應液的顏色接近擴增 陽性對照管則說明有擴增，如果接近無模板和無引物的陰性對照,，  則說明無擴增,。 反應結(jié)果示例見左圖(9 為陰性，  10 為陽性)  ,。

16. 如果是用熒光 PCR 儀進行擴增,， 則可分析擴增曲線和 Ct。試劑盒提供的陽性對照 的 Ct 將小于 60,，如果大于 60,，說明試劑可能失效，  需跟廠家聯(lián)系,。無模板陰性 對照和無引物陰性對照的 Ct 將大于 90。如果任何小于 90,，則說明試劑或環(huán)境被 污染,，需重復實驗或跟廠家聯(lián)系。如果陽性對照和陰性對照 Ct 都在正常范圍,，則 分析樣品的 Ct,。Ct 小于 60 的判斷為陽性，大于 90 判為陰性,，  在 60-90 之間則 需要重復檢測,。

17. 如果使用 PCR 儀、金屬浴或水浴進行擴增,，肉眼檢測,，再使用熒光定量 PCR 儀 進行終點法熒光讀數(shù)來判斷陰陽性， 則先比較陽性對照和陰性對照。陽性對照樣品 擴增后信號增幅應該超過 100%,，  陰性對照擴增后信號增幅應該低于 50%,，否則 實驗無效， 請與廠家聯(lián)系,。如果兩個對照均有效,，則比較樣品擴增前后熒光讀數(shù)的 差值。如果擴增后熒光信號增幅低于 50%,，則判斷為陰性,。如果熒光信號增幅高 于 100%，則判斷為陽性,。熒光信號增幅在 50- 100%之間的,，  則需要重測。

18. 當實時熒光檢測和可視化檢測同時用于判讀結(jié)果時,，如果彼此不一致,， 以實時熒光 LAMP 的數(shù)據(jù)為準。一般可視化結(jié)果滯后實時熒光檢測結(jié)果 20-30 分鐘,，也就是 說,，在 qPCR 儀上第 30 分鐘時呈現(xiàn)陽性的樣品，  其反應液的顏色變化一般在第

50-60 分鐘時才能觀察到,。