一.實(shí)驗(yàn)原理：ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記,。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí),，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng),。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上,。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析,。
二.實(shí)驗(yàn)材料與試劑配制：
儀器與材料：酶標(biāo)儀（使用前預(yù)熱30分鐘）,，微量加液器、吸頭,、蒸餾水或去離子水,，濾紙。
2. 洗液的配制：按1:30的比例配制洗液備用,。
三.樣品收集,、處理及保存
1.細(xì)胞培養(yǎng)上清：適用于檢測(cè)體外培養(yǎng)的細(xì)胞分泌性成份。用無(wú)菌管收集細(xì)胞上清液,，以1000×g離心15分鐘,，收集上清。
2.細(xì)胞：用PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞3次,，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)到104-106/ml 左右,，通過(guò)反復(fù)凍融，使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,，或者細(xì)胞超聲粉碎,，離心取上清液檢測(cè)。
3.血清：在室溫下,，血液自然凝固,，以1000×g離心15分鐘，取上清待測(cè),。
4.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合后靜置10-20 分鐘后，以1000×g離心15分鐘,，收集上清,。
5.體液：包括胸腹水、腦脊液,，分泌物等。使用不含熱原和內(nèi)毒素的離心管收集，以1000×g離心15分鐘,，收集上清,。
6.組織標(biāo)本：切取組織標(biāo)本，稱(chēng)取重量0.5mg,，加入500ul 的PBS,，用手工或勻漿器，或超聲破碎儀將標(biāo)本勻漿,，以2000-3000rmp離心20 分鐘,，收集上清進(jìn)行檢測(cè)。
樣品中不能含有NaN3,，因NaN3 抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性,。
7.保存：如果樣品不能立即檢測(cè)，應(yīng)將其分裝,，-70 ℃保存,，避免反復(fù)冷凍。保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。血液標(biāo)本盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中含大量顆粒,，檢測(cè)前先離心或過(guò)濾,。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。
四.操作步驟： 
1.取出試劑盒,，室溫（20-25℃）放置30分鐘。
2.分組：取出96孔板,，根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),，把剩余的板條繼續(xù)冷藏處理。分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品組（6個(gè)濃度）,、空白孔,、待測(cè)樣品組。
3.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋?zhuān)簻?zhǔn)備小試管6 只,，依次編好號(hào)碼,，先在各小試管中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100ul，然后取原濃度標(biāo)準(zhǔn)品100ul加入一只已編好號(hào)的試管中,，充分混勻;再在該試管中取100ul 加入第二支試管中,，充分混勻；再在該試管中取100ul加入第三只試管中,，充分混勻,；再在該試管中取100ul 加入第四只試管中,，充分混勻；再在該試管中取100ul加入第五只試管中,，充分混勻,；然后在該試管中取100ul，棄掉,。第六只試管作為0 號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品,。
注：為減少實(shí)驗(yàn)誤差，保證準(zhǔn)確性,，建議設(shè)置復(fù)孔,。
4.加樣：依照標(biāo)準(zhǔn)品的順序分別加入50ul的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中；空白對(duì)照孔加入50ul的蒸餾水,；其余微孔中先加樣品40ul然后再加生物素標(biāo)記的抗體10ul,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,。
5.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
6.洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液,，靜置30 秒棄去,，如此重復(fù)5 次，拍干,。
7.加酶標(biāo)溶液：標(biāo)準(zhǔn)品組,、待測(cè)樣本組各孔中加入50ul的酶標(biāo)溶液（空白對(duì)照孔除外）。
8.溫育：酶標(biāo)板用封板紙密封后,，放入濕盒內(nèi)于37℃恒溫孵育1小時(shí),。
9.洗板：用稀釋后的洗滌液注滿(mǎn)每孔，靜置15-30s,，充分清洗酶標(biāo)板5次,，用吸水紙*拍干。
10.顯色：各孔加入顯色劑A液50ul后,，再加入顯色劑B液50ul,。
11.終止：25-37℃下避光反應(yīng)10-15分鐘，加入50ul終止液,。
12.讀板：在450nm波長(zhǎng)讀取各孔的OD值,。
注：讀板時(shí)必須拭干板底殘留的液體和手指痕跡，讀板時(shí)間控制在終止反應(yīng)后的30分鐘內(nèi),，以免影響準(zhǔn)確性,。
五.數(shù)據(jù)計(jì)算：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度，即為樣品的實(shí)際濃度,。
六.注意事項(xiàng)：
1.實(shí)驗(yàn)操作中必須使用一次性吸頭,，避免交叉污染。
2.加樣：加樣時(shí),，要控制加樣速度,，避免*孔與zui后一孔間的時(shí)間間隔過(guò)大，否則將會(huì)導(dǎo)致不同的預(yù)孵育時(shí)間,，從而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性以及重復(fù)性,。
3.孵育：嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)上規(guī)定的孵育時(shí)間和溫度進(jìn)行。
4.反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化,，如果顏色較深,，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)。
5.建議實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)樣品含量,，如樣品濃度過(guò)高,，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋?zhuān)?jì)算結(jié)果時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
6.建議使用本試劑盒時(shí)先做預(yù)實(shí)驗(yàn)（即先做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，試用幾個(gè)標(biāo)本）,，如果對(duì)本試劑盒有任何疑問(wèn)，可和所購(gòu)經(jīng)銷(xiāo)商,，如果因運(yùn)輸過(guò)程導(dǎo)致試劑盒失效,，可要求調(diào)換，但概不承擔(dān)產(chǎn)品本身以外的任何損失,。
六.保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：2-8℃
2.有效期：6個(gè)月
訂貨說(shuō)明：
賣(mài)方確保所訂產(chǎn)品與目錄技術(shù)指標(biāo)保持*,；
B.為了確保買(mǎi)方產(chǎn)品在運(yùn)輸中的質(zhì)量，對(duì)有特殊要求的低溫產(chǎn)品予以濕冰運(yùn)輸,。
C.收到貨物后如出現(xiàn)質(zhì)量問(wèn)題,，買(mǎi)方需在收到貨物一個(gè)月內(nèi)向賣(mài)方提出書(shū)面異議。買(mǎi)方逾期不提出異議,，視為貨物符合其要求,，賣(mài)方不付任何責(zé)任。
D.出現(xiàn)質(zhì)量以外的問(wèn)題,，如破損等,，買(mǎi)方應(yīng)在收貨后一個(gè)周內(nèi)提出,。買(mǎi)方未按時(shí)提出異議，視為該產(chǎn)品合格,。
本公司對(duì)所有售出的產(chǎn)品保證質(zhì)量,，并提供良好的售后服務(wù)，有關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的投訴,，請(qǐng)?jiān)谑盏截浳锏?69天內(nèi)以書(shū)面形式提出,，并向我公司技術(shù)人員提供相應(yīng)的材料，我們會(huì)及時(shí)派人解決,。所有形式的賠償或退換*于產(chǎn)品本身,，不涉及其他間接內(nèi)容。凡購(gòu)買(mǎi)本公司任意款elisa試劑盒,，均可享受免費(fèi)代測(cè)服務(wù),，并提供技術(shù)指導(dǎo)。

溫馨提示：不可用于臨床治療,。