禽腺病毒I群(FADV-I）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：禽腺病毒I群 (FADV-I）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法）

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

禽腺病毒感染主要感染家禽,，一旦感染容易通過家禽消化道及呼吸道進(jìn)行擴散,，引起家禽暴發(fā)流行性疾病,，引起病雞出現(xiàn)精神不振、排稀糞便,，心包積液滲出,、肝脹腫脹出血，造成家禽死亡,，禽腺病毒I群為常見型,，包括A\B\C\D\E型。本試劑盒適用于檢測呼吸道分泌物棉拭子（感染I群禽腺病毒的雞,、火雞、鵝,、鵪鶉）,、卵巢、輸卵管,、卵泡,、子宮和輸卵管粘膜組織、泄殖腔拭子（感染I群禽腺病毒的雞,、鴨）等樣本中的禽腺病毒感染的輔助診斷,，其檢測結(jié)果僅供參考。

【檢驗原理】

本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù),，選用3套引物探針組合,，包含禽腺病毒I群的A型,C型,E型的特異性基因，分別設(shè)計1對特異性引物,，并結(jié)合1條特異性探針,，用熒光PCR技術(shù)對禽腺病毒的核酸進(jìn)行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷,。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用,。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存,、運輸,、反復(fù)凍融少于7次，有效期12個月,。

【適用儀器】

ABI ,、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler,、Bio-Rad,、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。

【標(biāo)本采集】

    病死禽取卵巢,、輸卵管,、卵泡,、子宮和輸卵管粘膜組織；活雞取呼吸道拭子或泄殖腔拭子,，放于1mL 50%甘油生理鹽水中,。

【保存和運輸】

上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃,，但不能超過6個月,，標(biāo)本運送應(yīng)采用2~8℃冰袋運輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融,。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1 樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g,，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨,，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中,；泄殖腔拭子直接取100μL進(jìn)行DNA提取,。

1.2 DNA提取

為了使實驗結(jié)果穩(wěn)定、有效,、可靠,，建議使用商品化的RNA 提取試劑盒進(jìn)行提取，嚴(yán)格按照對應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作,。

2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù),，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份,，多配制1份),，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟1提取的DNA、陽性質(zhì)控品,、陰性質(zhì)控品各取5μL,，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋,，混勻,，短暫離心。

4. PCR擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi),；

4.2 設(shè)置好通道,、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25μL,；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM檢測禽腺病毒A型,，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5. 結(jié)果分析判定

5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析,，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時,，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),，重新分析結(jié)果。

5.2 結(jié)果判斷

陽性：檢測通道Ct值≤35.0,，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線,。

可疑：檢測通道35.0<Ct值<38.0，且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復(fù)試驗,，重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn)Ct值<38.0且有典型擴增曲線者為陽性,，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無Ct值且無明顯的擴增曲線,。

6. 檢測方法的局限性

? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集,、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān),；

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果,；

? 陽性對照,、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果,；

? 病原體在流行過程中基因突變,、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果,；

? 不同的提取方法存在提取效率差異,，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 試劑運輸,，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

? 本檢測結(jié)果僅供參考,，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段,。

7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線且無Ct值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期,，且Ct值≤30,；

以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效,。

8. 性能指標(biāo)

（1）敏感性：內(nèi)控樣本敏感性為100%,，綜合評價敏感性98%以上。最低檢測限不低于1000copies/ml。

（2）特異性：100%,。

（3）穩(wěn)定性：批內(nèi)及批間差異≤3%,。

【注意事項】

? 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,，完全混勻并短暫離心,；

? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在,，管蓋需蓋緊,；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服,；

? 樣本處理,、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,，以免交叉污染,；

? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理,。

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