石蠟冰凍切片TUNEL凋亡熒光

TUNEL凋亡熒光實(shí)驗(yàn)原理

dUTP缺口末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,，TUNEL) 法檢測細(xì)胞凋亡的原理是當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),DNA內(nèi)切酶被激活,，核小體間的基因組DNA被切斷,，暴露的3-0H可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TerminalDeoxynucleotidyl Transferase, TdT)加上帶有熒光素FITC標(biāo)記的dUTP,從而可以通過熒光顯微鏡進(jìn)行檢測,。

TUNEL凋亡熒光實(shí)驗(yàn)意義

1.TUNEL法是一種分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法,，可對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞或者凋亡小體進(jìn)行原位染色,，可以準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征。

2.可用于石蠟切片,、冰凍切片,、培養(yǎng)的細(xì)胞等進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)方法要高,。

3.操作簡便快捷,，在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。

TUNEL凋亡熒光實(shí)驗(yàn)步驟:

1.石蠟切片TUNEL顯色法:

①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,，脫蠟劑= =甲苯,，至水劑乙醇;

②PBS漂洗3*5 min; .

③加入蛋白酶K工作液379C反應(yīng)15-30 min, PBS漂洗3x5 min;

④4%多聚甲醛(pH7 4的PBS)室溫固定15-30 min, PBS漂洗3x5 min;

⑤浸入封閉液(3%H202)室溫封閉10 min, PBS漂洗3x5 min;

⑥參考使用試劑盒的說明書配制適量的TUNEL檢測液，其中含有TdT酶,、熒光標(biāo)記液,、TUNEL檢測液;

⑦樣品上加入適量TUNEL檢測液，37°C避光孵育60 min, PBS漂洗3x5 min;

⑧選擇是否用DAPI復(fù)染細(xì)胞核;

⑨使用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2.冰凍切片TUNEL顯色法:

①新鮮組織經(jīng)處理后,，立即在恒冷冰凍切片機(jī)內(nèi)切片,，厚度為5~6 um;

②防脫玻片，貼片,，室溫陰干約12h;③4%多聚甲醛(pH7 .4的PBS)室溫固定10 min,

PBS漂洗3x5 min;

④浸入封閉液(3%H20O2) 室溫封閉10 min, PBS漂洗3x5 min;

⑤浸入通透液(0.1%Triton X-100溶于PBS中),，室溫通透30 S-2 min;

⑥參考使用試劑盒的說明書配制適量的TUNEL檢測液，其中含有TdT酶,、熒光標(biāo)記液,、TUNEL檢測液;

⑦樣品上加入適量TUNEL檢測液，37°C避光孵育60 min, PBS漂洗3x5 min;

⑧選擇是否用DAPI復(fù)染細(xì)胞核:

⑨使用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察,。

結(jié)果展示

實(shí)驗(yàn)完成周期及交付標(biāo)準(zhǔn)

1.實(shí)驗(yàn)周期: 1-2周

2.交付標(biāo)準(zhǔn):蠟塊,、切片、染色圖片.實(shí)驗(yàn)報(bào)告(實(shí)驗(yàn)步驟,、試劑,、耗材等)

需確認(rèn)的信息

1.樣本的種屬

2.樣本的類型(固定的組織or蠟塊or切片)

3.是否提供試劑盒

4.拍照要求

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