日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

產(chǎn)品推薦:氣相|液相|光譜|質(zhì)譜|電化學|元素分析|水分測定儀|樣品前處理|試驗機|培養(yǎng)箱


化工儀器網(wǎng)>技術中心>工作原理>正文

歡迎聯(lián)系我

有什么可以幫您? 在線咨詢

PCR反應各個組分和條件

來源:上海恒斐生物科技有限公司   2015年12月24日 16:19  

PCR反應組分

引 物

引物與模板配對的長度應至少為17個核苷酸,,zui高不宜超過30個核苷酸,,*長度為20-24個核苷酸,如需插入酶切位點,,應在酶切位點5'端多加幾個堿基,,有利于酶切。引物的(G+C)%含量組成應均勻,,盡量避免含有相同的堿基多聚體,;兩個引物中(G+C)%含量應盡量相似;引物內(nèi)部應避免形成明顯的二級結構,,如發(fā)夾結構;兩個引物之間不應發(fā)生互補,;特別是在引物3'端有富有GC,,這樣退火后有利于3'端的延伸。人工合成的引物需經(jīng)過色譜層析或PAGE純化,,以除去未能合成至全長的短鏈等雜質(zhì),。引物的終濃度一般為0.1-1μM左右,濃度太高會導致非特異性擴增,,太低則擴增產(chǎn)物太少,。

模 板

模板可以是單鏈DNA,也可以是雙鏈DNA,,質(zhì)粒DNA的擴增效率略低于線狀DNA,。模板量一般不需太多,不超過1μg為宜,,因為模板量過多可能導致非特異性擴增增加,,但是要考慮模板中靶序列的含量。例如:使用基因組為模板擴增單拷貝或低拷貝靶序列,,就需要適當加大模板用量,。

反應緩沖液

緩沖液的PH值,鹽離子濃度,、助溶劑成分等都會對PCR反應產(chǎn)生影響,。我公司提供的Taq酶通用緩沖液PH值為8.4。Mg2+濃度為1.5mM,可以適用于大多數(shù)PCR反應,,但它并非對任何模板和引物的組合都是*的,。

酶  量

50μl反應體系可用0.5-5U酶,酶量的選擇與模板DNA的量,、擴增片段大小等有關,,酶量過多易發(fā)生非特異性反應,而且可能增加突變的機率,,尤其在進行高保真擴增時,,應盡量減少酶量,但酶量過少時反應性能會下降,。

 

PCR反應條件

變性溫度與時間

模板變性溫度是決定PCR反應中雙鏈DNA解鏈的溫度,,達不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈DNA模板,PCR也就不會啟動,。變性溫度低則變性不*,,DNA雙鏈會很快復性,因而減少產(chǎn)量,。變性溫度太高,,又會影響酶的活性,一般情況下可設為94℃ 20-30秒,,高溫時間應盡量縮短,,以保持耐熱DNA聚合酶的活力,zui高變性溫度不宜超過95℃,。

退火溫度與實踐

退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量,。溫度高特異性強,但過高則引物不能與模板牢固結合,,DNA擴增效率下降,;溫度低產(chǎn)量高,但過低可造成引物與模板錯配,,非特異性產(chǎn)物增加,。合適的退火溫度一般在45-68℃之間。設置特定反應的zui適退火溫度,,可根據(jù)引物的(G+C)%含量進行推測,,一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃,退火時間一般為30-60秒,,足以使引物與模板之間結合,,沒有必要長時間退火。

延伸溫度與時間

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70-75℃之間,,延伸時間根據(jù)所有聚合酶擴增速度和擴增片段大小設定,。如同樣擴增2kb片段,,若使用Taq酶只需要1分鐘,使用Pfu酶則應設定2分鐘以上,。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn),。時間太短則可能得不到擴增產(chǎn)物或得到一些短的非特異性片段。

循環(huán)次數(shù)

可根據(jù)模板DNA的量,,擴增片段的大小和擴增產(chǎn)物的下步應用等因素,,設定30-40個循環(huán)。循環(huán)次數(shù)太少,,擴增量不足,,如果循環(huán)次數(shù)太多,錯配幾率會增加,,非特異性背景嚴重,。所以,在保證產(chǎn)物得率的前提下,,應盡量減少循環(huán)次數(shù),。

免責聲明

  • 凡本網(wǎng)注明“來源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權或有權使用的作品,,未經(jīng)本網(wǎng)授權不得轉(zhuǎn)載,、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權使用作品的,,應在授權范圍內(nèi)使用,,并注明“來源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,,本網(wǎng)將追究其相關法律責任。
  • 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來源(非化工儀器網(wǎng))的作品,,目的在于傳遞更多信息,,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點和對其真實性負責,不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任,。其他媒體,、網(wǎng)站或個人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時,必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來源,,并自負版權等法律責任,。
  • 如涉及作品內(nèi)容、版權等問題,,請在作品發(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,,否則視為放棄相關權利。
企業(yè)未開通此功能
詳詢客服 : 0571-87858618