PCR反應(yīng)組分

引 物

引物與模板配對的長度應(yīng)至少為17個核苷酸,，zui高不宜超過30個核苷酸,，*長度為20-24個核苷酸,，如需插入酶切位點,，應(yīng)在酶切位點5'端多加幾個堿基,，有利于酶切,。引物的（G+C）%含量組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體,；兩個引物中（G+C）%含量應(yīng)盡量相似,；引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯的二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu),；兩個引物之間不應(yīng)發(fā)生互補,；特別是在引物3'端有富有GC，這樣退火后有利于3'端的延伸,。人工合成的引物需經(jīng)過色譜層析或PAGE純化,，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質(zhì)。引物的終濃度一般為0.1-1μM左右,，濃度太高會導(dǎo)致非特異性擴增,，太低則擴增產(chǎn)物太少。

模 板

模板可以是單鏈DNA,，也可以是雙鏈DNA,，質(zhì)粒DNA的擴增效率略低于線狀DNA。模板量一般不需太多,，不超過1μg為宜,，因為模板量過多可能導(dǎo)致非特異性擴增增加，但是要考慮模板中靶序列的含量。例如：使用基因組為模板擴增單拷貝或低拷貝靶序列,，就需要適當(dāng)加大模板用量,。

反應(yīng)緩沖液

緩沖液的PH值，鹽離子濃度,、助溶劑成分等都會對PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響,。我公司提供的Taq酶通用緩沖液PH值為8.4。Mg2+濃度為1.5mM,，可以適用于大多數(shù)PCR反應(yīng),，但它并非對任何模板和引物的組合都是*的。

酶  量

50μl反應(yīng)體系可用0.5-5U酶,，酶量的選擇與模板DNA的量,、擴增片段大小等有關(guān)，酶量過多易發(fā)生非特異性反應(yīng),，而且可能增加突變的機率,，尤其在進(jìn)行高保真擴增時，應(yīng)盡量減少酶量,，但酶量過少時反應(yīng)性能會下降,。

PCR反應(yīng)條件

變性溫度與時間

模板變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈DNA模板,，PCR也就不會啟動,。變性溫度低則變性不*，DNA雙鏈會很快復(fù)性,，因而減少產(chǎn)量,。變性溫度太高，又會影響酶的活性,，一般情況下可設(shè)為94℃ 20-30秒,，高溫時間應(yīng)盡量縮短，以保持耐熱DNA聚合酶的活力,，zui高變性溫度不宜超過95℃,。

退火溫度與實踐

退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強,，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合,，DNA擴增效率下降；溫度低產(chǎn)量高,，但過低可造成引物與模板錯配,，非特異性產(chǎn)物增加。合適的退火溫度一般在45-68℃之間,。設(shè)置特定反應(yīng)的zui適退火溫度,，可根據(jù)引物的（G+C）%含量進(jìn)行推測,，一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，退火時間一般為30-60秒,，足以使引物與模板之間結(jié)合,，沒有必要長時間退火。

延伸溫度與時間

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70-75℃之間,，延伸時間根據(jù)所有聚合酶擴增速度和擴增片段大小設(shè)定,。如同樣擴增2kb片段，若使用Taq酶只需要1分鐘,，使用Pfu酶則應(yīng)設(shè)定2分鐘以上,。延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。時間太短則可能得不到擴增產(chǎn)物或得到一些短的非特異性片段,。

循環(huán)次數(shù)

可根據(jù)模板DNA的量,，擴增片段的大小和擴增產(chǎn)物的下步應(yīng)用等因素，設(shè)定30-40個循環(huán),。循環(huán)次數(shù)太少,，擴增量不足，如果循環(huán)次數(shù)太多,，錯配幾率會增加,，非特異性背景嚴(yán)重。所以,，在保證產(chǎn)物得率的前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù),。