PCR反應(yīng)組分
引 物
引物與模板配對的長度應(yīng)至少為17個核苷酸,,zui高不宜超過30個核苷酸,,*長度為20-24個核苷酸,,如需插入酶切位點,,應(yīng)在酶切位點5'端多加幾個堿基,,有利于酶切,。引物的(G+C)%含量組成應(yīng)均勻,盡量避免含有相同的堿基多聚體,;兩個引物中(G+C)%含量應(yīng)盡量相似,;引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯的二級結(jié)構(gòu),如發(fā)夾結(jié)構(gòu),;兩個引物之間不應(yīng)發(fā)生互補,;特別是在引物3'端有富有GC,這樣退火后有利于3'端的延伸,。人工合成的引物需經(jīng)過色譜層析或PAGE純化,,以除去未能合成至全長的短鏈等雜質(zhì)。引物的終濃度一般為0.1-1μM左右,,濃度太高會導(dǎo)致非特異性擴增,,太低則擴增產(chǎn)物太少。
模 板
模板可以是單鏈DNA,,也可以是雙鏈DNA,,質(zhì)粒DNA的擴增效率略低于線狀DNA。模板量一般不需太多,,不超過1μg為宜,,因為模板量過多可能導(dǎo)致非特異性擴增增加,但是要考慮模板中靶序列的含量。例如:使用基因組為模板擴增單拷貝或低拷貝靶序列,,就需要適當(dāng)加大模板用量,。
反應(yīng)緩沖液
緩沖液的PH值,鹽離子濃度,、助溶劑成分等都會對PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響,。我公司提供的Taq酶通用緩沖液PH值為8.4。Mg2+濃度為1.5mM,,可以適用于大多數(shù)PCR反應(yīng),,但它并非對任何模板和引物的組合都是*的。
酶 量
50μl反應(yīng)體系可用0.5-5U酶,,酶量的選擇與模板DNA的量,、擴增片段大小等有關(guān),酶量過多易發(fā)生非特異性反應(yīng),,而且可能增加突變的機率,,尤其在進(jìn)行高保真擴增時,應(yīng)盡量減少酶量,,但酶量過少時反應(yīng)性能會下降,。
PCR反應(yīng)條件
變性溫度與時間
模板變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度,達(dá)不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈DNA模板,,PCR也就不會啟動,。變性溫度低則變性不*,DNA雙鏈會很快復(fù)性,,因而減少產(chǎn)量,。變性溫度太高,又會影響酶的活性,,一般情況下可設(shè)為94℃ 20-30秒,,高溫時間應(yīng)盡量縮短,以保持耐熱DNA聚合酶的活力,,zui高變性溫度不宜超過95℃,。
退火溫度與實踐
退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量。溫度高特異性強,,但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合,,DNA擴增效率下降;溫度低產(chǎn)量高,,但過低可造成引物與模板錯配,,非特異性產(chǎn)物增加。合適的退火溫度一般在45-68℃之間,。設(shè)置特定反應(yīng)的zui適退火溫度,,可根據(jù)引物的(G+C)%含量進(jìn)行推測,,一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃,退火時間一般為30-60秒,,足以使引物與模板之間結(jié)合,,沒有必要長時間退火。
延伸溫度與時間
PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70-75℃之間,,延伸時間根據(jù)所有聚合酶擴增速度和擴增片段大小設(shè)定,。如同樣擴增2kb片段,若使用Taq酶只需要1分鐘,,使用Pfu酶則應(yīng)設(shè)定2分鐘以上,。延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。時間太短則可能得不到擴增產(chǎn)物或得到一些短的非特異性片段,。
循環(huán)次數(shù)
可根據(jù)模板DNA的量,,擴增片段的大小和擴增產(chǎn)物的下步應(yīng)用等因素,設(shè)定30-40個循環(huán),。循環(huán)次數(shù)太少,,擴增量不足,如果循環(huán)次數(shù)太多,,錯配幾率會增加,,非特異性背景嚴(yán)重。所以,,在保證產(chǎn)物得率的前提下,應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù),。
相關(guān)產(chǎn)品
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