注意事項(xiàng)

1. 在使用前，一抗二抗均應(yīng)測(cè)試其合適的稀釋度,。

2. 多聚甲醛的固定是不穩(wěn)定的,，標(biāo)本經(jīng)多聚甲醛固定后，應(yīng)再用去污劑處理,，如果標(biāo)本在水溶液中浸泡的時(shí)間過長(zhǎng),，則會(huì)使交聯(lián)結(jié)構(gòu)解體,。因此,，應(yīng)避免固定后的標(biāo)本在水溶液中浸泡的時(shí)間過長(zhǎng),。

3. 信號(hào)微弱的解決方法：

① 提高一抗和二抗的濃度以增強(qiáng)敏感性 ，這必須測(cè)試各種濃度抗體的滴度；

② 延長(zhǎng)一抗和二抗的孵育時(shí)間,。由于細(xì)胞染色時(shí)抗原吸附在固相載體上，抗原抗體結(jié)合時(shí)間較在溶液中長(zhǎng),。孵育時(shí)間可因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)作適當(dāng)調(diào)整,，但少于20min抗體和抗原幾乎不能有效結(jié)合,。在以上兩點(diǎn)中，應(yīng)摸索出一個(gè)*條件以產(chǎn)生有效信號(hào)且保持良好的背景,。這就需要反復(fù)試驗(yàn)，因?yàn)槊拷M抗體和抗原的情況會(huì)有所不同,；

③ 改變檢測(cè)方法,，用共聚焦顯微鏡觀察,，可提高敏感性,。

4. 背景不好的解決方法

細(xì)胞樣本進(jìn)行熒光染色時(shí),，背景問題主要來自兩個(gè)方面,，即非特異性染色和特異性交叉反應(yīng)。

① 非特異性吸附：非特異性吸附背景問題的產(chǎn)生與抗原抗體的特異性結(jié)合無關(guān),。即一抗或二抗與樣品相互作用而發(fā)生吸附,，而不是與抗原發(fā)生特異性結(jié)合,。

*將所有抗體溶液或含蛋白的檢測(cè)試劑用100,，000′g離心30min以去除蛋白聚合物。

*滴定一抗和所用的檢測(cè)試劑,，以確定能夠產(chǎn)生合適信號(hào)的zui低濃度,。

*固定后,，用飽和量并不被檢測(cè)試劑結(jié)合的非特異性抗體封閉樣品,，有效的封閉液包括5%的與標(biāo)記二抗來源相同的同種血清,、3%的BSA和3%的脫脂奶粉。

*用上述封閉液稀釋抗體和檢測(cè)試劑。

*固定后,，在所有的緩沖液及洗滌液中加入2%吐溫-20。

*縮短一抗或標(biāo)記試劑的孵育時(shí)間,。

*充分洗滌（延長(zhǎng)洗滌時(shí)間,，重復(fù)次數(shù)）。

*改變檢測(cè)方法,。

② 特異性背景：造成特異性背景問題的原因有三種因素，即污染抗體所致假陽性,、交叉反應(yīng)和樣品中含有能與Ig結(jié)合的蛋白質(zhì)。

*如用多克隆抗體,，應(yīng)滴定抗體（假陽性）,。

*如用多克隆抗體，親和純化特異性抗體（假陽性）,。

*如用多克隆抗體,，用適當(dāng)?shù)谋闻K粉吸收以阻抑假陽性,。

*換用其他抗體（交叉反應(yīng)及假陽性）。