血清結(jié)晶紫的配制

隨著熒光定量PCR技術(shù)的成熟和熒光定量PCR儀的普及,，用傳統(tǒng)的半定量方法檢測目的基因表達(dá)量的升高或者降低,，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前科研的需要,，針對當(dāng)前研究的熱點(diǎn)基因,，閃晶生物及時地從美國biosuper公司引進(jìn)不同物種,、不同基因的熒光定量PCR檢測試劑盒,。該試劑盒包含了目的基因和內(nèi)參基因的引物、taqman探針（熒光探針）,、反轉(zhuǎn)錄試劑,、熒光定量PCR試劑、操作說明書等,，用戶只需將提好的RNA加入就可以進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),，操作方便簡單、適合多種熒光定量PCR儀,，同時也避免了自己設(shè)計,、合成引物探針的煩惱。目前主要是人,、大鼠,、小鼠的大部分基因，其它物種的基因需來電或來信咨詢,。
首先,:含 1%結(jié)晶紫的無水乙醇,過濾,除去雜質(zhì); 染色方法:用 PBS 緩沖液 洗細(xì)胞 1-2 次,吸盡殘余的液體.加入甲醇固定 20 分鐘,棄固定液,晾干,加入結(jié)晶紫染 液,染色 10-20 分鐘,棄染色液,用水沖洗干凈即可
分離單個核細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作步驟
1.無菌靜脈穿刺采血,，肝素抗凝（20 u/ml 全血） ，并加等量生理鹽水稀釋,。 2.在 15 ml 離心管中加入 4 ml 淋巴細(xì)胞分離液（室溫） ,，吸取 6 ml 經(jīng)稀釋的抗凝血，小心滴加到分離液液面 上,。 （此步小心操作,，勿將血液與分離液混合。 ） 3.室溫下離心,，2000 rpm,，15 min，離心后液體分 4 層,，從上至下分別為：血漿層,、單個核細(xì)胞層、淋巴細(xì) 胞分離液層,、紅細(xì)胞及多形核細(xì)胞層,。 （附圖） 4.用吸管小心吸取中間混濁懸浮顆粒層（hPBMC 層） ，轉(zhuǎn)到新的離心管內(nèi)，每管zui多加 5 ml 細(xì)胞懸液,，補(bǔ)加 PBS 至 10 ml,，吹勻。

5.離心,，2000 rpm,，10 min，棄上清,，再次加 10 ml PBS 洗滌沉淀,。離心，1500 rpm,，6 min,，棄上清。 6.每支離心管加 3 ml RPMI 1640 培養(yǎng)液（含 10%胎牛血清,、100 u/ml 青霉素,、100 u/ml 鏈霉素） ，吹勻制成 細(xì)胞懸液,。 7.取 90 µl 細(xì)胞懸浮液與 10 µl 0.4%臺盼藍(lán)溶液加入 1.5 ml EP 管中,，混勻。 8.立即取 10 µl 混合液從血球計數(shù)板計數(shù)池上方凹槽加入,，蓋上蓋玻片,，于 100 倍倒置顯微鏡下觀察計數(shù)，活 細(xì)胞不染色,，死細(xì)胞則為藍(lán)色,。

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