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布魯氏菌疫苗株A19,、野毒株檢測試劑盒說明書

來源:上海臻科生物科技有限公司   2025年07月09日 09:21  

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱:布魯氏菌疫苗株A19、野毒株檢測試劑盒(雙色實時熒光PCR法)

英文名稱:Brucella vaccine strain A19, wild strainDetection Kit (Dual Chanel Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/& 50T/

【預(yù)期用途】

布魯氏菌疫苗株A19,、野毒株Brucellosis)是由布魯氏菌疫苗株A19,、野毒株Brucella)引起的畜源性人畜共患傳染病,在牛,、羊,、豬中常發(fā)生,患病家畜是人類布魯氏菌疫苗株A19、野毒株病的主要傳染源,。近年來全國各地布魯氏菌疫苗株A19,、野毒株病疫情有上升的趨勢,給畜牧業(yè)發(fā)展及人類身體健康帶來極大的危害和威脅,,造成巨大的經(jīng)濟損失和嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,。本試劑盒利用實時熒光PCR原理,定性檢測布魯氏菌疫苗株A19,、野毒株,,對布魯氏菌疫苗株A19、野毒株診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義,。

【檢驗原理】

本試劑盒針對布魯氏菌疫苗株A19,、野毒株基因設(shè)計特異性引物和分子信標(biāo)探針,在待檢樣本中含有布魯氏菌疫苗株A19,、野毒株DNA的情況下,,PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)熒光信號進行實時監(jiān)測和輸出,,實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析,。

【主要組成成份】

序號

組成

25T/

50T/

1

 布魯氏菌疫苗株A19、野毒株 PCR反應(yīng)液

500 μL×1

1000 μL×1

2

布魯氏菌疫苗株A19,、野毒株 性對照

40 μL×1

 40 μL×1

3

布魯氏菌疫苗株A19,、野毒株 性對照

40 μL×1

 40 μL×1

4

說明書

1

1

注:陰性對照為滅菌純水,陽性對照為布魯氏菌疫苗株A19,、野毒株靶基因的質(zhì)粒,。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復(fù)凍融,,有效期12個月,。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列 ,、Roche LightCycler 480Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 如使用原始標(biāo)本進行檢測,。標(biāo)本(病人腦脊液,、靜脈血、關(guān)節(jié)液,;病畜靜脈血,,乳汁;菌落,,菌苔等)應(yīng)為新鮮采集并使用雙蒸滅菌水或滅菌生理鹽水懸浮的原始標(biāo)本,。

2. 如需在增菌后進行PCR檢測,則應(yīng)使用選擇性增菌液對原始標(biāo)本進行增菌,。

3. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測,,可置于28℃冷藏過夜保存;如需長期保存,,標(biāo)本應(yīng)凍存于-20-80,。

【檢驗方法】

1. 試劑準(zhǔn)備(試劑準(zhǔn)備區(qū))

1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體,。

2)核算當(dāng)次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)(n),,并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當(dāng)次實驗所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)(1T+陽性對照數(shù)(1T+誤差預(yù)留量(1T+樣本數(shù)

單反液配制表()

PCR反應(yīng)液UNG酶及Taq酶)

20 μL

3)在無菌離心管中加入上述試劑,,充分混勻后瞬時離心,。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū),。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存,。

2.樣本準(zhǔn)備(樣本處理區(qū))

DNA/RNA提取試劑盒提取核酸即可,具體操作按照其試劑盒說明書操

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA5 μl,、終體積25 μl/管,,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,,轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。

4.PCRPCR擴增區(qū))

1)取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,,并記錄放置順序,。

2)按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增。


反應(yīng)體積

25 μL

通道選擇

FAM通道采集布魯氏菌野毒株熒光信號

HEX通道采集布魯氏菌疫苗株A19熒光信號

PCR

反應(yīng)

條件

步驟

條件

循環(huán)數(shù)

UNG處理

372分鐘(min

1

預(yù)變性

953分鐘(min

1

PCR擴增

95℃5秒(s

40

55℃40秒(s

(此階段結(jié)束時采集熒光信號)

注:ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,,設(shè)置淬滅基團選擇None,。

【參考值(參考范圍)】

1.試劑盒有效性判定:

1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct≤35

2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,,線形為直線或輕微斜線,,無指數(shù)增長期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定:

1陽性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct≤35或有明顯指數(shù)增長期,。

2)可疑:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在3538范圍內(nèi),。此時應(yīng)對標(biāo)本進行重復(fù)檢測,,如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在3538范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期,,則判定為陽性,,否則為陰性。

3)陰性:標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值,。

【檢驗結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果

標(biāo)本檢測結(jié)果解釋

FAM

HEX

+

+

標(biāo)本中檢布魯氏菌野毒株,,疫苗株A19 

+

-

標(biāo)本中檢布魯氏菌野毒株,未檢出疫苗株A19 

-

+

標(biāo)本中檢布魯氏菌疫苗株A19 ,,未檢出野毒株

-

-

標(biāo)本中檢出布魯氏菌野毒株,、疫苗株A19 

【檢驗方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集,、運輸,、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

3. 樣本在采集,、運輸,、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,則容易得到假陽性結(jié)果,。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最di檢出限為103 Copies/mL,,產(chǎn)品CV3%

【注意事項】

1. 使用本試劑盒的實驗室,,應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理,;

2. 為避免RNA降解,樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作,,且完成實驗后立即上機檢測,;樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理

3. 各區(qū)域物品均為專用,,不得交叉使用,,以免污染檢測結(jié)束后,,應(yīng)立即對工作臺清潔,;

4. 吸取反應(yīng)液時,應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡,; PCR 儀前,,應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確,;

5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,,并應(yīng)瞬時離心;

6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),,并單獨存放,;

7. 為防止熒光干擾,,應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標(biāo)記,;

8. 檢測過程中使用過的吸頭,,應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管,,切忌開蓋,并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄,;工作臺及各種實驗用品應(yīng)定期用 10%次氯酸,、75%酒精或紫外燈進行消毒

9. 儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置,;不同批號試劑不能混用,;并在有效期內(nèi)使用


 


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