一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1,、hPSC誘導(dǎo)分化肺類器官試劑盒（abs90128-1kit）

產(chǎn)品組成：

2、輔助試劑

3,、實(shí)驗(yàn)耗材

 二,、誘導(dǎo)流程圖

三,、培養(yǎng)方法

1、hPSC分化為內(nèi)胚層細(xì)胞（DE） （按6孔板1孔算）
（1）基質(zhì)膠在4℃下解凍,，與DMEM/F12均勻混合,，鋪板，備用,。
（2）當(dāng)hiPSC的匯合度達(dá)到75%-85%,，吸去培養(yǎng)基，用2mL 1x室溫PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)清洗hiPSC,，吸去PBS,。
（3）加入1mL含Y-27632（10 μM）的室溫Accutase，轉(zhuǎn)移到37℃ 5% CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中20 min,，使其解離成單細(xì)胞,。
（4）20 min后,，將hESC/iPSC 培養(yǎng)基以等體積直接加入Accutase中，并使用P-1000吸頭輕輕上下吹打細(xì)胞,，制成單細(xì)胞懸液,，將細(xì)胞單懸液收集到15mL離心管中，室溫下300 g離心5 min,。
（5）從基質(zhì)膠包被的板中小心地抽吸包被液而不損壞基質(zhì)膠涂層表面,。
（6）離心結(jié)束,，充分去除上清,，將1 mL預(yù)熱的Advance 人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基（含10μM Y-27632）重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻,。
（7）使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞,，使用臺盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞，將密度為2.0 *10⁵個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞接種到步驟1制備的6孔基質(zhì)膠包被的板上,，在6孔板中每孔最終體積為2 mL,，將孔板轉(zhuǎn)移到37℃、5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h,。
（8）24h后（第1天）吸去培養(yǎng)基,，并加入1.97mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基1+10μL補(bǔ)充劑A+20μL補(bǔ)充劑B。
（9）在第2天和第3天,，吸去培養(yǎng)基,，加入1.98mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基1+20μL補(bǔ)充劑B，開始分化為內(nèi)胚層細(xì)胞,。

2,、DE誘導(dǎo)分化為前腸內(nèi)胚層細(xì)胞(AFE)
（1）第4天，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基,，在6孔板中每孔用2 mL1x室溫PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)清洗培養(yǎng)物,，然后從孔中移除PBS，每孔加入2 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基2,。
（2）將培養(yǎng)板放入37℃ 5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，每24h更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)3天,。

3,、AFE誘導(dǎo)分化為肺祖細(xì)胞(LPC)（以12孔板4個(gè)孔為例）
（1）29.92mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基3+80μL補(bǔ)充劑C配成LPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基
（2）第7天，從培養(yǎng)物中抽吸培養(yǎng)基,，在6孔板中每孔用2 mL1x室溫PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)清洗培養(yǎng)物,，吸去PBS。
（3）每孔加入1mL含Y-27632（10 μM）的室溫Accutase,，將培養(yǎng)物置于37℃ 5%CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育10 min,。
（4）10 min后每孔加入1mL DMEM/F12（含10μM Y-27632）,，輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞脫離孔底,。
（5）將細(xì)胞懸液收集到15 mL離心管中,，室溫下300 g離心5 min。
（6）仔細(xì)抽吸上清液,，不干擾細(xì)胞,，用1mL恢復(fù)室溫的LPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10μM Y-27632）重懸細(xì)胞，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻,。
（7）使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞,，使用臺盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞，將密度為2.0 x10⁵個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞接種到提前制備的12孔基質(zhì)膠包被的板上,，在12孔板中每孔培養(yǎng)基最終體積為1 mL,。
（8）第二天，更換為不含Y-27632的LPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基,。每隔一天更換培養(yǎng)基,，持續(xù)11天。

4,、LPC誘導(dǎo)分化為3D肺類器官（以24孔板6個(gè)孔為例）
（1）第18天,，14.965mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基4+35μL補(bǔ)充劑D配制成3D類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)基
（2）在冰上解凍基質(zhì)膠，并將移液器吸頭提前置于-20℃冰箱中,。
（3）吸出LPC誘導(dǎo)培養(yǎng)基,，用1 mL1xPBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺)洗滌1次。
（4）加入含10μM Y-27632的室溫Accutase（0.5 mL/12孔）并在37℃,、5% CO₂培養(yǎng)箱中孵育10 min,；10 min后每孔加入1mL恢復(fù)室溫的DMEM/F12（含10μM Y-27632），輕輕吹打細(xì)胞,，使細(xì)胞脫離孔底,。
（5）將細(xì)胞懸液收集到15 mL離心管中，室溫下300 g離心5 min,。
（6）仔細(xì)抽吸上清液,，不干擾細(xì)胞，用1mL 3D類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,，輕輕地上下移液以確保單細(xì)胞溶液均勻,。
（7）使用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，使用臺盼藍(lán)排除死亡細(xì)胞,。
注意：每個(gè)細(xì)胞系必須優(yōu)化細(xì)胞數(shù)量,；在分化的18天內(nèi)，細(xì)胞不應(yīng)變得過度融合。
（8）室溫下以300 g離心5 min,，吸出培養(yǎng)基并將細(xì)胞重懸于冷基質(zhì)膠中,，對于ESC，每孔4.0*10⁴個(gè)細(xì)胞添加200μL基質(zhì)膠,，對于iPSC,，每孔 8.0*10⁴個(gè)細(xì)胞，添加200 μL基質(zhì)膠,，將基質(zhì)膠與細(xì)胞一起置于冰上,。
（9）將200μL基質(zhì)膠/細(xì)胞混合物按每孔30μL接種到24孔板中。
（10）將板置于37℃,、5%CO₂培養(yǎng)箱中20-30分鐘使基質(zhì)膠凝固,。
（11）每孔加入700μL 3D類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并每隔一天更換培養(yǎng)基,，持續(xù)6天,。
（12）在第23天，14.96mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基5+40μL補(bǔ)充劑E配制成3D類器官分化培養(yǎng)基,，將孔里的培養(yǎng)基更換為700μL恢復(fù)室溫的3D類器官分化培養(yǎng)基，每隔一天更換培養(yǎng)基,，持續(xù)6天,。
（13）在第29天，199.48mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基6+520μL補(bǔ)充劑F配制成3D類器官成熟培養(yǎng)基,，將孔里的培養(yǎng)基更換為700μL恢復(fù)室溫的3D類器官成熟培養(yǎng)基,，每隔一天更換培養(yǎng)基，進(jìn)行長期培養(yǎng),。

5,、3D肺類器官傳代
（1）取出冷凍的基質(zhì)膠置于4℃解凍，并提前將槍頭放置在-20℃預(yù)冷1h,；
（2）吸除培養(yǎng)基,，加入1mL預(yù)冷的類器官傳代消化液，靜置1min,；
（3）使用1mL移液槍,，吹打孔中混合物40-50次，注意：不要產(chǎn)生氣泡,；
（4）每孔加入1mL預(yù)冷的PBS,，將混合物轉(zhuǎn)移到15mL離心管中；
（5）用1mL預(yù)冷的PBS清洗培養(yǎng)板,，并將該清洗液加入上一步的離心管中,，并補(bǔ)充預(yù)冷的PBS，使離心管中的終體積為12mL；300g離心5min,，去上清,；
（6）用預(yù)冷槍頭按每孔30μL的量在離心管中加入適量的基質(zhì)膠，吹打5-8次,，均勻混合單細(xì)胞-基質(zhì)膠,，注意吹打過程中避免產(chǎn)生氣泡；
（7）將提前放在培養(yǎng)箱中的24孔板取出,，在孔中心位置加入30μL膠滴,，緩慢打入混合液時(shí)，逐漸向上移動(dòng)槍頭,，使細(xì)胞均勻分布在膠中,；
（8）將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中，20-30min,，使膠滴凝固,；
（9）小心沿孔壁加入700μL恢復(fù)室溫的3D類器官成熟培養(yǎng)基，每隔1天換液一次（可周一,、周三,、周五換液，周五可添加至800μL,，周六,、周日不換液），注意：不要碰到膠滴,，將孔板放到培養(yǎng)箱中,，繼續(xù)培養(yǎng)。