一,、背景

小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞是從3T3細胞（Swissalbino）中經(jīng)克隆分離得到的連續(xù)傳代的亞系。該細胞從快速分裂到匯合和接觸性抑制狀態(tài)經(jīng)歷了前脂肪細胞到脂肪樣細胞的轉變,。該細胞鼠痘病毒陰性,；可產生甘油三酯，高濃度血清可增強細胞內脂肪堆積。

二,、小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞培養(yǎng)步驟

1）復蘇小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘,，棄去上清液,，補加4-6mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入6cm皿中）,，培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細胞密度。

2）小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%,，即可進行傳代培養(yǎng),。

對于小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞，傳代可參考以下方法：

1,、棄去培養(yǎng)上清,，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞1-2次,。

2,、加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min,，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺,，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的*培養(yǎng)基終止消化,。

3、輕輕吹打小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞,，脫落后吸出,，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液,，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻,。

4、按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液,，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中,。

3）小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存,。貼壁細胞凍存時,，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后,，進行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清,，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO,，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。

三,、應用

小鼠前脂肪胚胎成纖維細胞可以用于KRAS對3T3-L1,、C2C12細胞增殖、自噬和成脂分化的影響：

研究使用si RNA敲降Kras的表達水平,探究其對3T3-L1和C2C12細胞增殖,、自噬,、成脂分化和脂質蓄積的影響及作用機制。首先,為探究KRAS對3T3-L1和C2C12細胞增殖能力的影響,本研究利用si-KRAS抑制KRAS表達后,通過Ed U和CCK-8方法檢測增殖變化;通過q RT-PCR檢測細胞增殖相關基因Mtor,、Pcna和Myc的m RNA表達水平的變化,。

結果表明,敲降KRAS后,3T3-L1和C2C12細胞增殖比例(分別為對照組的0.89±0.07、0.90±0.05倍)以及CCK-8細胞增殖活力均顯著下降(分別為對照組的0.82±0.02倍和0.80±0.02倍);增殖相關基因Mtor,、Pcna和Myc的m RNA表達水平也顯著下降,。

隨后,探討了KRAS對細胞自噬的影響。在抑制KRAS表達后,通過免疫熒光染色檢測細胞質內LC3B的表達變化;通過Western blot檢測細胞自噬關鍵蛋白LC3B-II/LC3B-I的表達變化;通過q RT-PCR檢測自噬相關基因Beclin 1和Atg7的m RNA表達變化,。

相關結果表明,敲降KRAS后,3T3-L1和C2C12細胞內LC3B的熒光強度(分別為對照組的1.78±0.11倍和1.38±0.04倍)及LC3B-II/LC3B-I的水平顯著增加(分別為對照組的2.25±0.06倍和1.84±0.14倍),并且,Beclin 1和Atg7的m RNA水平也顯著上升,。最后,我們探討了KRAS對3T3-L1和C2C12細胞成脂分化的影響及作用機制。

在敲降KRAS后,本研究通過油紅O(ORO)染色,、甘油三酯水平檢測以及成脂相關基因Dgat1,、Scd1、C/ebpβ和Hmgr的m RNA表達水平檢測明確了KRAS對成脂分化和脂質蓄積的影響;通過Western Blot方法檢測了MAPKs(ERKs,、JNKs和p38),、PI3K磷酸化水平的變化;通過分別添加MAPK和PI3K通路的激活劑ANI和740 Y-P,探究KRAS對3T3-L1和C2C12細胞成脂的潛在作用機制。

結果表明,抑制KRAS表達后,細胞內甘油三酯水平(分別為對照組的1.24±0.02倍,、1.24±0.01倍),、ORO OD520值以及Dgat1、Scd1和C/ebpβm RNA表達水平顯著增加,ERK1/2,、JNK1/2/3,、p38以及PI3K的磷酸化水平顯著下降。

并且,MAPK通路激活劑ANI可以顯著下調由抑制KRAS引起的甘油三酯水平的上升,而740 Y-P對敲降KRAS引起的甘油三酯水平變化則沒有下調作用,反而進一步加強了脂質蓄積,。

綜上,本研究表明KRAS可以調控3T3-L1和C2C12細胞增殖,、自噬和成脂分化。研究結果有助于從分子水平解析脂肪的形成和積累的過程及機制,從而為調控肉類營養(yǎng)和成分,、提升肉質提供了理論依據(jù),。

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