一、目的

檢測生產(chǎn)車間操作人員手部,、與食品有直接接觸面的機械設備的微生物指標,，生產(chǎn)區(qū)域環(huán)境當中病原微生物的監(jiān)控，達到規(guī)定標準,，以控制食品成品的質(zhì)量,。

二、參照標準

中華人民共和國國家標準《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準》GB 15979－2002,、《HACCP原理與實施》,、2004年《出入食品微生物檢驗培訓教材》中《出入食品生產(chǎn)廠衛(wèi)生細菌檢驗方法》、日本東京冷凍食品檢驗方法,。

三,、采樣與檢測方法

3.1工作臺（機械器具）表面與工人手表面采樣與測試方法：

3.1.1樣品采集：

(1)取樣頻率：

a)車間轉換不同衛(wèi)生要求的產(chǎn)品時，在加工前進行擦拭檢驗,，以便了解車間衛(wèi)生清掃消毒情況,。

b)全廠統(tǒng)一放長假后，車間生產(chǎn)前,，進行全面擦拭檢驗,。

c)產(chǎn)品檢驗結果超內(nèi)控標準時，應及時對車間可疑處進行擦拭,，如有檢驗不合格點,，整改后再進行擦拭檢驗。

d)實驗新產(chǎn)品,，按客戶規(guī)定擦拭頻率擦拭檢驗,。

e)對工作表面消毒產(chǎn)生懷疑時，進行擦拭檢驗,。

f)正常生產(chǎn)狀態(tài)的擦拭,，每周一次。

(2)采樣方法：

a)工作臺（機械器具）：用浸有滅菌生理鹽水的棉簽在被檢物體表面（取與食品直接接觸或有一定影響的表面）取25cm2的面積,，在其內(nèi)涂抹10次,，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢,。

b) 工人手：被檢人五指并攏,，用浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來回涂擦10次,，然后剪去手接觸部分棉棒,，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內(nèi)送檢。

(3)采樣注意事項：擦拭時棉簽要隨時轉動,，保證擦拭的準確性,。對每個擦拭點應詳細記錄所在分場的具體位置,、擦拭時間及所擦拭環(huán)節(jié)的消毒時間。

3.1.2 菌落總數(shù)之大腸菌群的檢測培養(yǎng):

樣液稀釋：將放有棉棒的試管充分振搖,。此液為1：10稀釋液,。如污染嚴重，可十倍遞增稀釋,，吸取1mL1：10樣液加9mL無菌生理鹽水中,，混勻，此液為1：100稀釋液,。

3.1.2.1 菌落總數(shù)：（按GB 4789.2的規(guī)定進行）

（1）以無菌操作,，選擇1～2個稀釋度各取1mL樣液分別注入到無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個平皿（平行樣）,，將已融化冷至46℃左右的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾入平皿,，每皿約15~20mL，充分混合,。

（2）待瓊脂凝固后,，將平皿翻轉，置36℃±1℃培養(yǎng)48h后計數(shù),。

（3）結果報告：報告每25c㎡食品接觸面中或每只手的菌落數(shù),。

3.1.2.2大腸菌群：（按GB 4789.3的規(guī)定進行）

（1）平板法：

a)以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1mL樣液分別注入到無菌平皿內(nèi),，每個稀釋度做兩個平皿（平行樣）,，將VRBA培養(yǎng)基傾入平皿，每皿約15~20mL,，充分混合,。待瓊脂凝固后,再覆蓋一層培養(yǎng)基，約3-5mL,。

b)待瓊脂凝固后,，將平皿翻轉，置36℃±1℃培養(yǎng)24h后計數(shù),。

c)證實實驗：從VRBA平板上挑取典型和可疑菌落接種BGLB進行證實實驗。

d)結果計算：經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以平板上出現(xiàn)的典型和可疑菌落個數(shù)乘以稀釋倍數(shù)得出,。

e）結果報告：報告每25c㎡食品接觸面中或每只手的菌落數(shù),。

（2）MPN法：

a)以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1mL樣液分別接種到LST肉湯培養(yǎng)基中,，每個稀釋度接種三管,。

b)置LST肉湯管于36℃±1℃培養(yǎng)48±2h。記錄所有LST肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù),。

c)選擇產(chǎn)氣渾濁的發(fā)酵管接種BGLB進行復發(fā)酵實驗,。

d）結果報告：按BGLB肉湯管產(chǎn)氣管數(shù),，查MPN表報告每25c㎡食品接觸面中或每只手的大腸菌群值。

3.1.2.3 金黃色葡萄球菌檢測（按GB 4789.10的規(guī)定進行）

（1）定性檢測

a)取1mL稀釋液注入滅菌的平皿內(nèi),，傾注15-20mL的B-P培養(yǎng)基,，（或是吸取0.1稀釋液，用L棒涂布于表面干燥的B-P瓊脂平板）,，放進36±1℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2小時,。

b)從每個平板上至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌的菌落作血漿凝固酶實驗。

c)結果報告：B-P瓊脂平板的可疑菌落作血漿凝固酶實驗為陽性,，即報告手（工器具）上有金黃色葡萄球菌存在,。

（2）定量檢測

a)以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1mL樣液分別接種到含10﹪氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基中,，每個稀釋度接種三管,。

b)置肉湯管于36±1℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48小時。劃線接種于表面干燥的B-P瓊脂平板,，置36℃±1℃ 培養(yǎng)45～48小時,。

c)從B-P瓊脂平板上，挑取典型或可疑金黃色葡萄球菌菌落接種肉湯培養(yǎng)基,，36℃±1℃培養(yǎng)20～24小時,。

d)取肉湯培養(yǎng)物做血漿凝固酶試驗，記錄試驗結果,。

e)報告結果：根據(jù)凝固酶試驗結果,，查MPN表報告每25c㎡食品接觸面中或每只手的金黃色葡萄球菌值。

關于培養(yǎng)基的選擇

一次性衛(wèi)生用品生產(chǎn)企業(yè)使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基檢測涂抹點的菌落總數(shù),，使用乳糖膽鹽培養(yǎng)基檢測采樣點的大腸菌群,。針對檢測目的不同食品企業(yè)可以選擇不同的培養(yǎng)基，比如檢測消毒處理后或生產(chǎn)過程中受污染的程度,，可以選擇平板計數(shù)瓊脂檢測菌落總數(shù),；檢測大腸菌群可以選擇乳糖膽鹽培養(yǎng)基。

關于采樣點的選擇

選擇食品接觸面,，食品接觸面是指生產(chǎn)過程中與所生產(chǎn)的食品直接接觸的設備,、工具器具、人,、水,、空氣、包材等,；或直接接觸的門把手,、電源開關等。

3.2工廠環(huán)境中病原體的檢測計劃與方法：

檢測計劃：為了保證食品安全,，工廠應該對生產(chǎn)環(huán)境中的病原微生物進行檢測和評估,，檢測項目包括李斯特菌,，沙門氏菌等病原體微生物，化驗室應該按照一定的計劃對生產(chǎn)場所環(huán)境中的病原體進行檢測,，其中包括地面,、下水道、排水溝,、墻壁,、天花板、設備框架,、運輸?shù)闹Ъ?，冷藏裝置、速凍機,、傳送帶,、設備的螺絲、維修工具等部位,。當某個點檢測到病員微生物時,，應該對環(huán)境中的相似點加大檢測頻率；在把所有的預定點檢測完后,，應該對環(huán)境中的病原微生物的存在狀況進行全面評估,，在下一次環(huán)境檢測循環(huán)過程中加強檢測容易出現(xiàn)病原體的環(huán)境點，達到持續(xù)改進的目的,。檢測頻率: 每月兩次,每次每個區(qū)域至少選取5個檢測點,分別進行檢測,。

3.2.1 環(huán)境李斯特菌的檢測方法（環(huán)境李斯特菌的測試片）

3.2.1.1 用涂抹棒，海綿或者其他采樣設備收集環(huán)境樣本,。

3.2.1.2 將收集的樣本添加10毫升滅菌的緩沖蛋白胨水,，將樣本與緩沖蛋白胨混合1分鐘，將樣品置于室溫（20-30℃）1小時,，最久不超過1.5小時,，以修復損傷的李斯特菌。

3.2.1.3 將測試片放在平坦處,，掀起上層膜,。

3.2.1.4 用移液器垂直滴加3毫升樣品到下層膜，將上層膜緩慢蓋下,，以免產(chǎn)生氣泡,。

3.2.1.5 輕輕將塑料壓板放在位于接種區(qū)上層膜上，不要壓,，扭轉或者滑動壓板。提起壓板等至少十分鐘,，以使膠體凝固,。

3.2.1.6 將測試片透明面朝上,，可疊放至十片，在37℃±1℃培養(yǎng)26-30小時,，可以用標準菌落記數(shù)器或者其他光學放大器判讀,，不要記數(shù)圓形輪廓上的菌落，因為他們不受選擇性培養(yǎng)基的影響,。

3.2.1.7 對于定性檢測,，根據(jù)紫紅色菌落是否存在，結果記為檢出或者未檢出,。

3.2.2 環(huán)境中沙門氏菌的檢測方法

3.2.2.1采樣地點: 選取采樣點時因盡量選取微生物容易滋生的地方,。

3.2.2.2 操作步驟3.2.2.2.1采樣應在生產(chǎn)開始后進行，用已浸潤過的棉拭在選定的被測表面旋轉涂抹約100c㎡的面積,，然后將棉拭放回涂抹試管并蓋緊,。        

3.3.2.2.2 將樣品帶回實驗室，每5個點混合成一個樣品, 登記編號,按照GB 4789.4標準及時檢測,，若有陽性結果出現(xiàn),，應逐步對所混合的每個點分別檢測。

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