一,、稱(chēng)取

用精度度0.01的電子天平稱(chēng)取培養(yǎng)基所需藥品,。先根據(jù)配方計(jì)算出配制一定量培養(yǎng)基所需各種成分藥品的量，然后用天平準(zhǔn)確稱(chēng)取,。稱(chēng)量時(shí)用稱(chēng)量紙折疊成簸箕狀盛放藥品,。稱(chēng)量紙折疊方法如圖所示。

二,、溶化

培養(yǎng)基放入燒杯或燒瓶中,，慢慢加入少量所需水，邊加入邊用玻棒攪拌,。如果培養(yǎng)基中不含有瓊脂,，培養(yǎng)基不需要加熱;如果含有瓊脂，則需要用電爐或者電熱板等加熱煮沸，溶解后,，再補(bǔ)齊所需水,，并攪拌均勻(如圖3所示)。如果配制的培養(yǎng)基量很大,，可用不銹鋼鍋加熱溶化,，可先用溫水加熱并隨時(shí)攪動(dòng)，防止焦化,，如有焦化現(xiàn)象,，配制的培養(yǎng)基就不能使用，要重新配制,。

配制培養(yǎng)基時(shí)不可用銅或鐵的容器溶化,，因銅或鐵制容器可能會(huì)使培養(yǎng)基中的銅和鐵的含量超標(biāo)，影響實(shí)驗(yàn)(培養(yǎng)基中銅含量大于0.3mg/L,，細(xì)菌不宜生長(zhǎng),，鐵含量超過(guò)0.14mg/L，妨礙細(xì)菌產(chǎn)毒素),。對(duì)容易發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀的藥品,，要分開(kāi)溶解,，后加入培養(yǎng)基，如磷酸氫二鉀和硫酸鎂,。

三,、調(diào)pH

雖然培養(yǎng)基中含有緩沖物質(zhì)成分，能使培養(yǎng)基的pH盡可能的保持在要求的范圍內(nèi),，但是配出的培養(yǎng)基若不符合要求,，就要進(jìn)行必要的調(diào)整。如果有已校準(zhǔn)pH計(jì),，可用pH計(jì),，如果沒(méi)有，可用精密的pH試紙,，再根據(jù)需要用1 mol/L氫氧化鈉或1mol/L鹽酸(微調(diào)可用0.1氫氧化鈉或0.1mol/L鹽酸)調(diào)制所需的pH,。培基的pH一般為7.4～7.6，也有酸性或堿性的,。用氫氧化鈉調(diào)整的需要高壓滅菌的培養(yǎng)基,，在調(diào)整pH時(shí)要調(diào)至高出所需0.1個(gè)～0.2個(gè)單位，因用氫氧化鈉調(diào)整時(shí),，高壓滅菌后,，培養(yǎng)基的pH要降低0.1~0.2。如培養(yǎng)基中含有碳酸鈣成分，可不pH,。

四,、過(guò)濾

配成的培養(yǎng)基，若無(wú)特殊要求,，可省略此步,。若有沉淀或渾濁.需要澄清的.液體培養(yǎng)基可用油紙過(guò)濾。而固體培養(yǎng)基可用中間夾一薄層脫脂棉的雙層紗布過(guò)濾,。如果過(guò)濾法還不能達(dá)到澄清的要求,，則可用蛋清澄清法，即培養(yǎng)基加熱冷卻到50~60℃,，裝入三角瓶?jī)?nèi)(不超過(guò)容量的二分之一),，按1000mL加人1個(gè)～2個(gè)雞蛋的蛋清，用力搖晃3-5min,，高壓蒸汽滅菌121℃,、20min，取出趁熱過(guò)濾即可,。

五,、分裝

配制好的培養(yǎng)基根據(jù)不同的用途分裝在三角瓶、試管等容器中,，分裝試管,，如果試管量很大，可用自動(dòng)分液器,，如果試管量少,，可用漏斗分裝。分裝量不超過(guò)容器容積的三分之二,。三角瓶以不超過(guò)容積的二分之一為宜;瓊脂斜面以不超過(guò)試管長(zhǎng)度的五分之一為宜,，滅菌后，擺成的斜面為培養(yǎng)基量的三分之一,，底層為三分之二的量為宜;半固體瓊脂分裝量為試管長(zhǎng)度的三分之一;用來(lái)接種或保菌的高層瓊脂,，分裝量為試管長(zhǎng)度的四分之一或三分之一，用來(lái)接種厭氧菌的要達(dá)到三分之二;瓊脂平板,，內(nèi)徑為90mm的以13mL~15 mL為宜,，內(nèi)徑70mm的平板為8mL~10 mL，制成的瓊脂平板若表面水分較多,，可將平板倒扣,，放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)30min，干燥后再用,。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝一小玻璃瓶(約20mL)與該批培養(yǎng)基同時(shí)滅菌,，為測(cè)定該批培養(yǎng)基終pH,。

六、滅菌

分裝好的培養(yǎng)基應(yīng)立即進(jìn)行滅菌,。滅菌的方法種類(lèi)如下：

1,、高壓蒸汽滅菌法

大多耐熱培養(yǎng)基都可用此法，小量分裝時(shí),，用121℃,，15min;滅菌量大時(shí)，用121℃,，30min滅菌;含糖類(lèi)的培養(yǎng)基只能113~115℃,，15min滅菌，避免糖類(lèi)遭破壞,。

2,、煮沸滅菌法

對(duì)含有不耐高溫物質(zhì)的培養(yǎng)基，可使用此方法,。

3,、過(guò)濾除菌

以過(guò)濾的方法除菌，用無(wú)菌操作技術(shù),，定量加入培養(yǎng)基,。血液、抗生素可用無(wú)菌操作技術(shù)抽取,，加入冷卻到50℃左右的培養(yǎng)基中,。培養(yǎng)基含有不耐熱的物質(zhì)時(shí)，可用此法,。

對(duì)LST培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌時(shí)，有時(shí)發(fā)酵管內(nèi)會(huì)有氣泡,。為防止發(fā)酵管內(nèi)產(chǎn)生氣泡,，可以采取以下幾項(xiàng)措施：

1、小倒管浸滿(mǎn)培養(yǎng)基(不留氣泡)后再加入到盛LST的試管中,。

2,、滅菌鍋關(guān)閉放氣閥前，將鍋內(nèi)氣體排干凈,。

3,、試管塞不要塞得太緊(使用硅膠塞的時(shí)候)，勿使用橡皮塞,。

4,、不要過(guò)早打開(kāi)滅菌鍋，要等滅菌鍋內(nèi)氣壓和溫度都降到與室溫一致或相差不大時(shí)再打開(kāi)滅菌鍋,。

如果以上情況都做到還有氣泡,，可用水做培養(yǎng)基組的對(duì)照試驗(yàn),，若培養(yǎng)基組有氣泡，而對(duì)照組沒(méi)有氣泡可確定是培養(yǎng)基自身的原因,。

七,、倒平板

滅菌融化的培養(yǎng)基冷卻到50℃后，倒入無(wú)菌干燥的培養(yǎng)皿中,。培養(yǎng)基的溫度不能過(guò)高,，否則容易在培養(yǎng)皿的內(nèi)蓋上形成太多的冷凝水;溫度太低，培養(yǎng)基又容易凝固成塊,，無(wú)法制成平板,。倒平板時(shí)，應(yīng)在靠近酒精燈火焰進(jìn)行,，以免外界的雜菌落入平板內(nèi),，左手拿培養(yǎng)皿，右手拿三角瓶的底部,，用左手的小指和手掌部位把三角瓶的棉塞拔下,，灼燒瓶口，用大拇指和食指把培養(yǎng)皿蓋打開(kāi)一條縫,，至瓶口剛好伸入,，倒入培養(yǎng)基，以鋪滿(mǎn)底為限,，不超過(guò)培養(yǎng)皿高度的三分之一,，迅速蓋好蓋，放在桌面上,，輕輕地轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿,，使培養(yǎng)基分布均勻，冷凝后即可,。

八,、擺斜面

裝在試管中的瓊脂培養(yǎng)基，在滅菌完成后,，趁熱立即擺放在木棒(或玻璃棒)上,，并成適當(dāng)?shù)男倍龋鋮s后,，瓊脂凝固即成斜面,。斜面長(zhǎng)度不用超過(guò)試管二分之一。

九,、質(zhì)量檢查

培養(yǎng)基滅菌后仔細(xì)檢查一遍,，發(fā)現(xiàn)有破裂、水分浸入,、色澤異常,、棉塞被培養(yǎng)基沾染,，都要丟棄，不能再用,。并測(cè)定其終pH,。還需進(jìn)行無(wú)菌檢查和效果檢查。無(wú)菌檢查是將滅菌后的培養(yǎng)基取1管(瓶)~2管(瓶),，37℃恒溫培養(yǎng)1d～2d,，確定無(wú)雜菌生長(zhǎng);效果檢查是用標(biāo)準(zhǔn)菌株接種在相關(guān)的培養(yǎng)基上檢查檢查菌的生長(zhǎng)、形態(tài)及生化情況,，與已知情況相符,。兩種情況都合格，配制的培養(yǎng)基方可使用,。

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