百歐博偉生物：凡把兩個不同性狀個體內(nèi)的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一起,，經(jīng)過遺傳分子間的重新重組合,，形成新遺傳型個體的方式,，稱為基因重組,。重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下,，也能產(chǎn)生新遺傳型的個體。

基因重組是雜交育種的理論基礎,。由于雜交育種選用已知性狀的供體菌和受體菌作為親本,。因此比誘變育種前進了一大步。同時也可消除某一菌株長期誘變導致產(chǎn)量上升緩慢現(xiàn)象,。因此它是一種重要的育種手段,。

原核微生物的基因重組

一、轉(zhuǎn)化 (transformation)

轉(zhuǎn)化是細菌中被發(fā)現(xiàn)的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移形式,。 l928 年 Griffith 用肺炎鏈球菌對小鼠的感染實驗以及 10 多年后 Avery 等體外轉(zhuǎn)化過程的實現(xiàn),，轉(zhuǎn)化因子 DNA 的證實,，是現(xiàn)代生命科學發(fā)展的重要起點,。

1,、幾個概念

轉(zhuǎn)化 受體菌直接吸收了來自供體菌的 DNA 片段，通過交換把它整合到自己的基因組中,，從而獲得了新的遺傳特性的現(xiàn)象,。

轉(zhuǎn)化子（ transformant ） 受體細胞經(jīng)復制分裂后出現(xiàn)了供體性狀的子代。

感受態(tài) (competence) 細菌能夠從周圍環(huán)境中吸收 DNA 分子進行轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài),。

2,、轉(zhuǎn)化的條件

包括受體菌與外源 DNA 的條件。

受體菌 只有處于感受態(tài)的細菌才能吸收外源 DNA 實現(xiàn)轉(zhuǎn)化,。細菌的感受態(tài)是一種生理狀態(tài),，它可以通過感受態(tài)因子（細菌生長到一定階段分泌一種小分子的蛋白質(zhì)）在細胞間的轉(zhuǎn)移而獲得。這種感受態(tài)因子與細胞表面受體相互作用,，誘導一些感受態(tài) -- 特異蛋白表達,，其中一種是自溶素，它的表達使細胞表面的 DNA 結(jié)合蛋白及核酸酶裸露出來,，使其具有與 DNA 結(jié)合的活性,。

現(xiàn)在可用人工的方法提高受體菌感受態(tài)的水平，通過以 CaCl2 ,、 cAMP 等處理,，后者可使感受態(tài)水平提高 10000 倍。

外源 DNA 必須具備兩個基本條件,，即具有高相對分子質(zhì)量和同源性：①轉(zhuǎn)化 DNA 的相對分子質(zhì)量通常在 1 × 10 7 以下,，約占細菌染色體組的 0.3 ％，否則活性喪失,；多數(shù)研究中,，基因轉(zhuǎn)移使用的是雙鏈線性 DNA ，某些單鏈,、共價閉合環(huán)狀 DNA 也可用于轉(zhuǎn)化,；②親緣關(guān)系越近， DNA 的純度越高,，則轉(zhuǎn)化率越高,。

3、轉(zhuǎn)化過程

主要通過 3 個步驟完成,。

感受態(tài)細胞的建立 可用人工方法提高受體菌的感受態(tài)水平,，通常以 CaCl 2 、 cAMP 等處理菌體,，后者可使感受態(tài)水平提日 l0 000 倍,。

DNA 的結(jié)合和攝取 首先是供體雙鏈 DNA 與受體細胞壁上的接受位點相結(jié)合,。此反應的最初是可逆的，但隨著與細胞膜蛋白的進一步作用,，其與細胞壁的結(jié)合則變得十分穩(wěn)定而不可逆,。隨后其中一條鏈被細胞表面上的核酸酶降解，降解產(chǎn)生的能量協(xié)助把另一條鏈推進受體細胞,。亦發(fā)現(xiàn)有完整的雙鏈被攝取的情況,，如革蘭氏陰性菌——嗜血桿菌。

轉(zhuǎn)化因子與染色體重組 當單鏈進入受體細胞后,，便與雙鏈結(jié)構(gòu)的受體染色體 DNA 同源片段發(fā)生交換重組,。即與受體菌 DNA 整合，形成供體 DNA-- 受體 DNA 復合物,，再通過 DNA 復制和細胞分裂而表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化性狀,，形成轉(zhuǎn)化子。

能夠發(fā)生轉(zhuǎn)化的微生物有：肺炎鏈球菌,、嗜血桿菌屬,、芽孢桿菌屬、假單胞桿菌屬,、奈瑟氏球菌屬,、葡萄球菌屬和根瘤菌屬等 20 多種菌。轉(zhuǎn)化性狀也多樣：如形態(tài)變化,、莢膜物質(zhì),、糖發(fā)酵、耐藥性,、抗原性,、致病力、代謝產(chǎn)物,、營養(yǎng)需要等的變化,。一般轉(zhuǎn)化率為 0.1 ％一 1 ％。

如果把噬菌體或其他病毒的 DNA （或 RNA ）抽提出,，用它去感染感受態(tài)的宿主細胞,，并進而產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒后代，這種特殊的轉(zhuǎn)化稱為轉(zhuǎn)染,。

二,、轉(zhuǎn)導 (transduction)

1952 年 Zinder 和 Lederberg 在驗證鼠傷寒沙門氏菌是否也存在接合現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)導現(xiàn)象。

通過缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介,，把供體細胞的 DNA 片段攜帶到受體細胞中,，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象,，稱為轉(zhuǎn)導,。獲得新性狀的受體細胞,，稱為轉(zhuǎn)導子 (transductant) 。攜帶供體部分遺傳物質(zhì) (DNA 片段 ) 的噬菌體稱為轉(zhuǎn)導噬菌體,。在噬菌體內(nèi)僅含有供體菌 DNA 的稱為缺陷噬茵體,；在噬菌體內(nèi)同時含有供體 DNA 和噬菌體 DNA 的稱為部分缺陷噬菌體 ( 部分噬菌體 DNA 被供體 DNA 所替換 ) 。根據(jù)噬菌體和轉(zhuǎn)導 DNA 產(chǎn)生途徑的不同,，可將轉(zhuǎn)導分為普遍性轉(zhuǎn)導和局限性轉(zhuǎn)導,。

1,、普遍性轉(zhuǎn)導 (general transduction)

通過缺陷噬菌體對供體菌任何 DNA 小片斷的“誤包”,，而實現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌的轉(zhuǎn)導現(xiàn)象，稱為普遍性轉(zhuǎn)導,。

普遍性轉(zhuǎn)導的機制——“包裹選擇模型”,，當噬菌體侵染敏感細菌并在細菌內(nèi)大量復制增殖時，亦把寄主 DNA 降解為許多小的片段,，在裝配時,，少數(shù)噬菌體 (10 -6 一 10 -8 ) 錯誤地包裝了宿主的 DNA 片段并能形成“噬菌體”，這種噬菌體稱普遍性轉(zhuǎn)導噬菌體 ( 為缺陷噬菌體 ) ,。隨著細菌的裂解,，轉(zhuǎn)導噬菌體也被大量釋放。當這些轉(zhuǎn)導噬菌體再次侵染受體菌時,，其中的供體 DNA 片段被注入受體菌,。

如果該 DNA 片段能與受體菌 DNA 同源區(qū)段配對，通過遺傳物質(zhì)的雙交換而進行基因重組并形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導子,，稱普遍性轉(zhuǎn)導,。如鼠傷寒沙門氏菌的 P22 噬菌體、大腸桿菌的 P1 噬菌體和枯草芽孢桿菌的 PBS1 和 SP10 等噬菌體中都能進行轉(zhuǎn)導,。

如果該 DNA 片斷不能與受體菌 DNA 進行交換,、整合和復制，只以游離和穩(wěn)定的狀態(tài)存在,，而僅進行轉(zhuǎn)錄,、轉(zhuǎn)譯和性狀表達，稱流產(chǎn)轉(zhuǎn)異,。發(fā)生流產(chǎn)轉(zhuǎn)導的細胞在其進行分裂后,，只能將這段外源 DNA 分配給一個子細胞，而另一子細胞僅獲得供體基因轉(zhuǎn)錄,、轉(zhuǎn)譯而形成的少量產(chǎn)物 -- 酶,，因此在表型上仍可出現(xiàn)輕微的供體菌特征，每經(jīng)分裂一次,，就受到一次“稀釋”,。所以能在選擇培養(yǎng)基上形成微小菌落就成了流成轉(zhuǎn)導子的特點,。

2、局限性轉(zhuǎn)導 (specialized transduction)

通過部分缺陷噬的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中,，并獲得表達的轉(zhuǎn)導現(xiàn)象）,。轉(zhuǎn)導后獲得了供體部分遺傳特性的重組受體細胞稱為局限轉(zhuǎn)導子。

（1）局限性轉(zhuǎn)導的機制——“形成模型” λ噬菌體的線狀雙鏈 DNA 分子的兩端為 12 個核苷酸單鏈（粘性未端 cos 位點）,，在溶源狀態(tài)下,，以前噬菌體狀態(tài)存在于細胞染色體上。被誘導后,，在裂解細菌時,，其以粘性末端形成的環(huán)狀分子通過滾環(huán)復制形成一個含多個基因組的 DNA 多聯(lián)體，以 2 個 cos 位點之間的距離決定其包裝片段的大小而進行切割,、包裝,，最終形成轉(zhuǎn)導噬菌體。在極少數(shù)情況下 ( 約 10 -5 ) ,，在前噬菌體兩端鄰近位點上與細菌染色體發(fā)生錯誤的切割,，使其重新形成的環(huán)狀 DNA 中，同時失去前噬菌體的一部分 DNA 和增加了一段相應長度的細菌宿主染色體 DNA ,，這樣形成的雜合 DNA 可正常被包裝,、復制。形成的新轉(zhuǎn)導噬菌體稱為部分缺陷噬體,。因為λ前噬菌體位點兩端是細菌染色體的 gal + ( 發(fā)酵半乳糖基因 ) 和 bio + ( 利用生物素基因 ) ,，故形成的轉(zhuǎn)導噬菌體通常帶有 gal + 或 bi0 + 基因，故這些部分缺陷噬菌體表示為λ dga1( 缺陷型半乳糖轉(zhuǎn)導噬菌體 ) 或λ dbio( 缺陷性生物素轉(zhuǎn)導噬菌體 ) ,。這些轉(zhuǎn)導噬菌體可重新侵入受體菌,，侵入后，噬菌體 DNA 與受體菌的 DNA 同源區(qū)段配對,，通過雙交換而整合到受體菌的染色體組上,，使受體菌獲得了供體的這部分遺傳特性。

（2）局限性轉(zhuǎn)導中的低頻轉(zhuǎn)導與高頻轉(zhuǎn)導 低頻轉(zhuǎn)導 (LFT) ：由于宿主染色體上進行不正常切離的頻率極低,，因而在裂解物中所含的部分缺陷噬菌體的比例是極低（ 10 -4 --10 -6 ）的,，這種裂解物稱為 LFT 裂解物。 LFT 裂解物在低 m.o.i(multiplicity of infection) 情況下感染宿主,，就可獲得極少量的轉(zhuǎn)導子,。高頻轉(zhuǎn)導 (HFT) ：形成轉(zhuǎn)導子的頻率很高，理論上可達 50 ％,，故稱之為高頻轉(zhuǎn)導,。其原因是因為供體菌為雙重溶源菌，它同時有兩種噬菌體整合在細菌的染色體上。例如,，大腸桿菌 K12 株,，其雙重溶源菌為 E.coli K12( λ / λ dg), 即其前噬體體有λ和λ dg 為缺陷噬菌體，帶有供體 gal + 基因,，但丟失了部分噬菌體本身的 DNA ,；而λ噬菌體為正常噬菌體，不帶 gal 基因,，但起輔助作用,，稱為輔助噬菌體，可彌補λ dg 的不足,，使λ dg 也能成為“完整噬菌體”而釋放,。這樣，一個細菌便可同時等量地釋放出λ dg 和λ兩種噬菌體,，這時的裂解物稱為 HFT 裂解物,，當用低   m.o.i 的 HFT 裂解物去感染另一個 E.coligal - 受體菌,，是可高頻率的把它轉(zhuǎn)化為能發(fā)酵乳糖的 E.coligal + 轉(zhuǎn)導子,。這種方式稱為高頻轉(zhuǎn)導。

當溫和噬菌體感染其宿主而使之發(fā)生溶源化時,，因噬菌體的基因整合到宿主的基因組,，而使后者獲得了除免疫以外的新性的現(xiàn)象，稱為溶源轉(zhuǎn)變,。

三,、接合 (conjugation)

指供體菌和受體菌完整細胞間的直接接觸，而實現(xiàn)大段的 DNA 傳遞現(xiàn)象,。

Iederberg 和 Tatum 于 1946 年設計了一個有名的實驗,，才證明了原核生物的接合現(xiàn)象。他們篩選出了兩種不同營養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌 K12 突變株,，其中 A 菌株是 met- ,、 bio- ， B 菌株是 thr- ,、 Leu- ,，將它們在培養(yǎng)基上混合培養(yǎng)后，再涂布于基本培養(yǎng)基上,。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，在基本培養(yǎng)基上出現(xiàn)了 met + 、 bi0 + ,、 thr + ,、 1eu + 的原養(yǎng)型菌落 ( 約為 10 -7 ) ，而分別涂布的兩種親本菌株對照組都不出現(xiàn)任何菌落,。進一步的實驗證實,，上述遺傳重組的形成,，是兩個親本細胞接合以后發(fā)生基因重組的結(jié)果。在細菌中,，接合現(xiàn)象發(fā)研究最清楚的是 E.coli ,，研究發(fā)現(xiàn) E.coli 是有性別分化的，決定性別的是一種質(zhì)粒,，即 F 因子?，F(xiàn)在根據(jù) E.coli 細胞中是否存在 F 因子以及在細胞中的存在方式不同，可把大腸桿菌分成以下四種類型,。

F + 菌株 F 因子以游離狀態(tài)存在,，可獨立于染色體進行自主復制。一般有 1-4 個,，且細胞表面有相當數(shù)量的性菌毛,。

F - 菌株 不含 F 因子，無相當數(shù)量的性菌毛,。

Hfr 菌株 F 因子整合在宿主染色體的一定部位,，并與宿主染色體同步復制。發(fā)現(xiàn) Hfr 與 F - 菌重組的頻率要比 F + 菌與 F - 菌重組的頻率高得多,。

F ′菌株 因為 F 因子整合到染色體上是一種可逆過程,，當 F 因子從 Hfr 菌染色體上脫落時，會出現(xiàn)一定概率的錯誤基因交換,，從而使 F 因子帶上宿主染色體的遺傳因子,，這時的 F 因子稱為 F ′因子。

幾種接合的結(jié)果

F+ × F- 接合 通過 F + 菌產(chǎn)生的性菌毛把兩者連接在一起,，并在細胞間形成胞質(zhì)橋 ( 或稱接管 ) ,， F 因子通過胞質(zhì)橋進入受體細胞，使重組體從 F - 變成了 F + 菌,。其主要過程是,， F 因子的一條 DNA 單鏈斷裂 ( 在特定位點上 ) 、解鏈,，并單向轉(zhuǎn)移進入受體細胞,，在此作為模板而形成新的 F 因子；另一條在供體細胞內(nèi)的 DNA 鏈也成為模板并以滾環(huán)模型形式復制,；最終供體菌及受體菌均成為 F + 菌,。

Hfr × F- 接合 當 Hfr 與 F- 菌株發(fā)生接合時， Hfr 的染色體雙鏈中的一條單鏈在 F 因子處發(fā)生斷裂,，由環(huán)狀變?yōu)榫€狀,， F 因子則位于線狀單鏈 DNA 之末端。整段線狀染色體也以 5- 末端引導，等速轉(zhuǎn)移至 F - 細胞,。在沒有外界因素干擾的情況下,，這一轉(zhuǎn)移過程的全部完成約需 100 分鐘。實際上由在轉(zhuǎn)移過程中,，使接合中斷的因子很多,，因此這么長的線狀單鏈 DNA 常常在轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生斷裂。所以處在 Ffr 染色體前端的基因,，進入 F- 的幾率就越高,，這類性狀出現(xiàn)在接合子中的就越早。由于 F 因子位于線狀 DNA 的末端,，進入 F- 細胞的機會最少,，故引起 F- 變成 F+ 的可能性也最小。因此 Hfr 與 F- 接合的結(jié)果其重組頻率雖,，但轉(zhuǎn)性頻率卻,。

F ′與 F- 接合 通過 F ′與 F- 的接合就可以使后者變成 F ′。它既可使后者前者的 F 因子,，同時雙獲得前者的部分遺傳性狀,。

四、原生質(zhì)體融合（ protoplast fusion ）

通過人為的方法,，使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合,，并進而發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生同時帶有雙親性狀的、遺傳性穩(wěn)定的融合子（ fusant ）的過程 .

能進行原生質(zhì)體融合的細胞是極其廣泛的,，不僅包括原核生物，而且還包括各種真核細胞,。原生質(zhì)體融合的性在于：

1,、它打破了微生物的種屬界限，可以實現(xiàn)遠緣菌株的基因重組,。 1981 年 Yamada 有 PEG 誘導酵母原生質(zhì)體與細菌細胞成功的融合,，并使其固氮作用或光合作用實現(xiàn)了不穩(wěn)定的表達。

2,、原生質(zhì)融合可使遺傳物質(zhì)傳遞更為完整,、獲得更多基因重組體的機會，有利于提高育種速度,。

此外原生質(zhì)體融合技術(shù)還可用于研究細胞質(zhì)遺傳,、核質(zhì)關(guān)系等問題，因此原生質(zhì)體融合技術(shù)在生產(chǎn)實踐及理論研究上均有具有重要意義,。

原生質(zhì)體融合技術(shù)及育種步驟

1,、原生質(zhì)體的制備

制備原生質(zhì)體是保證實現(xiàn)原生質(zhì)融合技術(shù)的關(guān)鍵。主要是要去除細胞壁。

2,、原生質(zhì)體再生

是指去壁后的原生質(zhì)體能重建細胞壁,，恢復細胞完整形態(tài)，并能生長,、分裂的過程,。這是原生質(zhì)融合育種的必要條件。通常在原生質(zhì)體融合前要測定原生質(zhì)體的再生率,，以此分析其融合率不高是由于雙親株原生質(zhì)體本來就沒有活性或再生率低,，還是由于融合條件不適所致。因此測定原生質(zhì)體形成率和再生率不僅可作為檢查,、改善原生質(zhì)體形成和再生條件的指標,，也是分析融合實驗結(jié)果，改善融合條件的一個重要指標,。

3,、原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合方法 主要有生物助融（通過病毒聚合劑如仙臺病毒等病毒和某些生物提取物等使原生質(zhì)體融合）、物理助融（離心沉淀,、電脈沖等）,、化學助融（通過化學助融劑如 PEG 加 Ca 2+ ）。

4,、融合子的檢出與鑒定

原生質(zhì)體融合育種的主要目的在于迅速準確地檢出各種類型的融合子,，并通過鑒定、篩選等步驟,，及時選出穩(wěn)定高產(chǎn)的融合子,。

①融合子的檢出

直接檢出法 將融合液涂布于親株生長所必要的營養(yǎng)物或存在抑制雙親生長的抑制物的再生平皿上。

間接法 用影印法

②融合子的鑒定

經(jīng)過傳代選出穩(wěn)定融合子,，可從形態(tài)學,、生理生化、遺傳學及生物學等幾方面進行鑒定,。如菌落形態(tài)和顏色變化,，代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量， DNA 含量分析等,。

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