單細胞測序已經(jīng)讓我們能以全新的方式理解細胞的生化過程,。然而目前的單細胞測序手段需要將細胞消化并裂解才能夠進行，而細胞狀態(tài)在這一操作中不可避免地會發(fā)生改變,，因此很難掌握細胞真實的基因表達情況,。針對于此，EPFL的Bart DePlanke博士和蘇黎世聯(lián)邦理工學院的Julia Vorholt博士利用多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)- FluidFM從單個細胞中獲得數(shù)千個轉(zhuǎn)錄物的序列，突破性地在不破壞細胞的情況下推斷基因活性,。該篇成果已發(fā)表于國際高水平學術期刊Nature上,。

      文獻使用FluidFM創(chuàng)建了一種原位活細胞基因測序方法Live-Seq，這種方法能夠在不殺死細胞的情況下完成對細胞的測序工作,。通過這種技術該團隊成功完成單細胞RNA基因測序,，并通過這種方法檢測到了細胞的基因表達和細胞周期狀態(tài)變化。

Live-Seq測序技術概述

    由于單個細胞的RNA總量僅有10 pg,。為了實現(xiàn)無損的單細胞測序,，科學家使用FluidFM對現(xiàn)有的scRNA-Seq單細胞測序的方法進行了優(yōu)化。為了盡可能地接近Smart-Seq的測試條件,，團隊采用了首先將緩沖液吸入探針,，然后再進行細胞提取的操作。這樣可以確保所提取的RNA能夠第一時間與緩沖液混合,，從而避免RNA的降解,。通過這一方法，該團隊成功實現(xiàn)了IBA細胞的測序,，證明了這種方法的可行性（圖1）,。

圖1. Live-Seq技術

Live-Seq技術的巨大潛力

    對于轉(zhuǎn)錄組測序,，傳統(tǒng)的單細胞轉(zhuǎn)錄組方法(scRNA-seq)和復雜的生物信息學模型用于重建細胞的歷史。然而,，由于scRNA-seq方法要求細胞是裂解后,，合理的細胞軌跡是推斷和間接的。Live-seq方法通過使研究人員能夠在不殺死單個細胞的情況下獲取單個細胞的轉(zhuǎn)錄組快照,，從而抵消了推斷方法的缺點,。

    Live-Seq技術的優(yōu)勢在于提取過程中不會破壞細胞,。通過對提取前后的測序?qū)Ρ瓤梢园l(fā)現(xiàn),，提取組與空白組之間的團簇沒有顯著性差異。并且通過對細胞形態(tài)的觀察中,，發(fā)現(xiàn)細胞的形態(tài)基本沒有改變,，并且多數(shù)細胞仍然能夠正常分裂（圖2）。

圖2. Live-Seq對細胞的多次提取，連續(xù)測序的示意圖和代表圖像,；整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE圖,。

    Live-Seq是一種十分具有前景的單細胞測序的新方法，得益于FluidFM技術的無損提取的優(yōu)勢，Live-Seq技術除了能夠?qū)崿F(xiàn)傳統(tǒng)測序的功能外,，還降低了細胞的損傷,，能夠提供更加原生和真實的測序信息。這種特點甚至讓單細胞的基因表達動力學研究成為可能,。相信隨著這種技術自動化的提高,，將為單細胞測序技術帶來更多可能。

    基于上述優(yōu)勢和原因,，瑞士Cytosurge公司推出全新的商品化Live-Seq解決方案：也就是說只要您遵循Cytosurge公司的操作流程,，就可以在實驗室輕松實現(xiàn)Live-Seq，這使得在具備FluidFM技術的實驗室也都在完quan相同細胞的轉(zhuǎn)錄組測序后獲得進一步的下游分子和表型分析成為可能,。但更重要的是,，Live-seq可以提供同一細胞隨時間變化的多個時間轉(zhuǎn)錄組快照。對于Live-seq全新解決方案,，F(xiàn)luidFM OMNIUM系統(tǒng)收集亞細胞物質(zhì),，而不會破壞細胞活力或生理。

    使用Live-seq可以使得研究人員在表型分析之前記錄細胞的轉(zhuǎn)錄組序列，對同一單個細胞的轉(zhuǎn)錄組進行序列分析,，進而直接繪制單個細胞的歷史軌跡并進行評估,。這樣單個細胞隨時間對刺激的反應將單個細胞的轉(zhuǎn)錄組與其相對位置聯(lián)系起來。同時,，基于FluidFM OMNIUM系統(tǒng)的Live-Seq解決方案是一種獨立的,，易于使用的自動化系統(tǒng)，允許您從活單細胞中提取和分離亞皮升體積,，以進行進一步分析,。另外，它是如此的溫和,，細胞提取后依然保持活力,。

    因此,，基于FluidFM OMNIUM系統(tǒng)的Live-Seq解決方案可讓您簡易、便捷地獲取單細胞遺傳信息,，進而讀取單細胞轉(zhuǎn)錄組的信息概況,，分析細胞狀態(tài)軌跡或細胞動力學。Live-Seq的基礎研究雖然目前僅處于起步階段,，但仍被一致認為具有光明的前景,，除此之外,，F(xiàn)luidFM技術的系統(tǒng)能力也開辟了各種其他組學實驗，如蛋白質(zhì)組學和代謝組學研究等,。

多功能單細胞顯微操作系統(tǒng)-FluidFM OMNIUM

參考文獻

[1] Y. Feng, S. Wang, X. Liu, Y. Han, H. Xu, X. Duan, W. Xie, Z. Tian, Z. Yuan, Z. Wan, L. Xu, S. Qin, K.  He, J. Huang. Geometric constraint-triggered collagen expression mediates bacterial-host adhesion. (2023) Nature Communications.

[2] W. Chen, O. Guillaume-Gentil, P. Yde Rainer, C. G. G?belein, W. Saelens, V. Gardeux, A. Klaeger, R. Dainese, M. Zachara, T. Zambelli, J. A. Vorholt, B. Deplancke. Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells. (2022) Nature.

[3] Y. Cui, X. Lyu, L. Ding, L. Ke, D. Yang, M. Pirouz, Y. Qi, J. Ong, G. Gao, P. Du & R.I. Gregory. Global miRNA dosage control of embryonic germ layer specification. (2021) Nature.

[4] Y. Guo, F. Mei, Y. Huang, S. Ma, Y. Wei, X. Zhang, M. Xu, Y. He, B.C. Heng, L. Chen & X. Deng. Matrix stiffness modulates tip cell formation through the p-PXN-Rac1-YAP signaling axis. (2021) Bioactive Materials.

[5] O. Guillaume-Gentil, R.V. Grindberg, R. Kooger, L. Dorwling-Carter, V. Martinez, D. Ossola, M. Pilhofer, T. Zambelli & J.A. Vorholt. Tunable Single-Cell Extraction for Molecular Analyses. (2016) Cell.