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豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞永生化分離培養(yǎng)及鑒定,、轉(zhuǎn)染方法

來(lái)源：鏡像綺點(diǎn)（上海）細(xì)胞技術(shù)有限公司 2024年05月15日 14:18

骨骼肌細(xì)胞是人和動(dòng)物體內(nèi)最大的細(xì)胞之一,，它們是由成肌細(xì)胞(Myoblasts)融合而來(lái)的多核細(xì)胞,，故骨骼肌的形成是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,，并需要多種細(xì)胞信號(hào)通路的參與,，包括phosphatidylinositol 3-kinase,，calcineurin,，STAT3和MAPK等,。原代骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)是研究細(xì)胞分化過(guò)程的有效的模型。

該細(xì)胞通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40基因,。

細(xì)胞來(lái)源于正常動(dòng)物肌肉組織,，通過(guò)肌動(dòng)蛋白（α-actin）免疫熒光染色鑒定為陽(yáng)性，細(xì)胞純度高于90%,。細(xì)胞形態(tài)位梭形,，不規(guī)則細(xì)胞，貼壁培養(yǎng),。

1.試驗(yàn)所需儀器設(shè)備及試劑

（1）儀器

儀器名稱(chēng)	規(guī)格型號(hào)	廠家
生物安全柜	BSC-1500ⅡA2-X	濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司
CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱	BC-J160S	上海博迅實(shí)業(yè)有限公司
熒光倒置顯微鏡	DS-Ri2	Nikon
高速冷凍離心機(jī)	Multifuge X1R	Thermo Fisher
電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱	DHG-9123A	上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司
電熱恒溫震蕩水槽	DK-2B	上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司

（2）試劑耗材

試劑名稱(chēng)	規(guī)格/貨號(hào)	廠家
T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶	430639	Corning
血球計(jì)數(shù)板	Neubauer improved	Marienfeld
24孔板專(zhuān)用細(xì)胞爬片	YA0350	Solarbio
細(xì)胞培養(yǎng)孔板	WHB-24	上海臥宏生物科技有限公司
胎牛血清	1414426	Gibco
骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基	Primed-iCell-018	賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司
0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）	1734858	Gibco
Collagenase Ⅰ	17018029	Gibco
Collagenase Ⅱ	17101015	Gibco
Collagenase Ⅳ	17104019	Gibco
多聚甲醛（PFA）	P1110	Solarbio
DAPI	C0060	Solarbio
Triton X-100	T8200	Solarbio
山羊血清	SL038	Solarbio
Myod	18943-1-AP	Proteintech
CoraLite594 – conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	SA00013-4	Proteintech
Fluoromount-G熒光封片劑	0100-01	SourthernBiotech

2．豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)

1) 首先將豬頸部動(dòng)脈放血致死,。

2) 小心剪取后肢肌肉，剔除脂肪,，筋膜,，血管等，

3) 用PBS漂洗肌肉2-3次,，

4) 將肌肉組織剪碎,，

5) 加入3倍體積的0.1% Ⅰ+Ⅱ+Ⅳ型膠原酶4℃冰箱過(guò)夜消化，

6) 第二天,，將混合液取出置于37℃水浴鍋中震蕩消化1h,，

7) 過(guò)100目篩網(wǎng)，

8) 收集濾液,，

9) 300g 離心5 min,，

10) 重懸沉淀,，鋪瓶

細(xì)胞分離培養(yǎng)：

豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞永生化分離培養(yǎng)及鑒定、轉(zhuǎn)染方法

100x 200x

原圖見(jiàn)文件-細(xì)胞分離培養(yǎng)

3．免疫熒光鑒定

3.1實(shí)驗(yàn)步驟

（1）細(xì)胞爬片

取3片玻璃片于24孔板中,，每孔加入培養(yǎng)基1mL,，加入細(xì)胞0.02million個(gè)/孔。置培養(yǎng)箱2h或過(guò)夜,。

（2）固定

細(xì)胞爬片后,，吸出培養(yǎng)基，用PBS洗1遍,，加入4% PFA于4℃固定30min,。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS,，放4℃過(guò)夜,。

（3）破膜封閉

將玻片除去水分，置于培養(yǎng)皿支撐物上,，

玻璃片封閉液配置：0.5% Trition X-100與PBS 1:1混合,，再加10% 血清，

取50uL破膜封閉液滴于防水膜上,，將玻片上有細(xì)胞的一面蓋上2h,。

（4）一抗孵育

一抗配制：抗體與PBS 1:100（200）稀釋

破膜封閉后，取50uL一抗于防水膜上（濕盒中）,，將玻片（有細(xì)胞的一面）蓋上置于4℃（最多可放置一周）

（5）二抗孵育

室溫避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后,，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min,，PBS洗3×5min/次,。

（6）包埋

玻片上各滴1滴Fluoromount-G，將有細(xì)胞的一面蓋上,。

鑒定細(xì)胞為P1代細(xì)胞

一抗為Myod

3.2免疫熒光鑒定結(jié)果

豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞永生化分離培養(yǎng)及鑒定,、轉(zhuǎn)染方法

100X-DAPI 100X-Fluorescence

原圖見(jiàn)文件-免疫熒光

4.轉(zhuǎn)染

4.1SV40過(guò)表達(dá)慢病毒基本信息

實(shí)驗(yàn)信息表：
產(chǎn)品名稱(chēng)	SV40過(guò)表達(dá)慢病毒
載體信息	載體元件信息	EF1α-SV40-IRES-puromycin
	攜帶熒光標(biāo)記	GFP □ RFP□	抗性基因標(biāo)記	Puromycin □ Blasticidin □
載體圖譜
載體目的序列信息如下： gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttcta ggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaat gaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatgg aactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaaca ttctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttg ctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacat actgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttg atgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaac aagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgttt aaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgcc aacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggat ataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaa aatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtgggggg aaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggagggga gtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaa agaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagatt atttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagttt gctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattg gagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcag ggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggtttt acttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaatctagacacagtgcagcactctcaacg ttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc 黃色區(qū)域?yàn)槟康男蛄袇^(qū)

4.2轉(zhuǎn)染

（1）將細(xì)胞接種6孔板,，每孔細(xì)胞數(shù)約為1×105 個(gè),，

（2）第二天，待細(xì)胞貼壁后,，換液,，

（3）加入1mLwan全培養(yǎng)基，再加20 μL SV40過(guò)表達(dá)慢病毒,，

（4）混勻后繼續(xù)培養(yǎng),，

（5）12h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，并更換為新鮮培養(yǎng)基,，

（6）當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)板底后,，傳代至T25培養(yǎng)瓶中,。

豬骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞永生化分離培養(yǎng)及鑒定、轉(zhuǎn)染方法

100x 200x

原圖見(jiàn)文件-轉(zhuǎn)染

5.篩選

5.1殺滅曲線的確定

（1）將未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按每孔0.05million鋪入24孔板,，孵育過(guò)夜,，

（2）第二天，除去24孔板中舊的培養(yǎng)基,，

（3）將含不同濃度嘌呤霉素（1μg/mL,，2μg/mL，3μg/mL,，4μg/mL,，5μg/mL，6μg/mL,，7μg/mL）的新鮮培養(yǎng)基加入已鋪有細(xì)胞的24孔板,，

（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基,，

（5）每天觀察細(xì)胞的存活比例,，

（6）最小的嘌呤霉素使用濃度就是從嘌呤霉素篩選開(kāi)始1-4d內(nèi)殺死所有細(xì)胞的zui低篩選濃度。

結(jié)果：嘌呤霉素的使用濃度為2μg/mL,，作用時(shí)間為2d,。

5.2嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞

（1）第一天，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按每孔0.05million鋪入24孔板,，孵育過(guò)夜

（2）第二天,，除去24孔板中舊的培養(yǎng)基，

（3）加入含嘌呤霉素（2μg/mL）的篩選培養(yǎng)基,，孵育,，

（4）每2天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，

（5）每天觀察細(xì)胞的存活比例,，

（6）在同一時(shí)間點(diǎn)（2d）存活的細(xì)胞,，即為轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，

（7）對(duì)篩選后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,。

6.細(xì)胞擴(kuò)增

將篩選后的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增,，篩選后的細(xì)胞為P1代，擴(kuò)增至少到12代,。

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100x 200x

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