1. SD大鼠,，250g,，通過頸椎脫位處死大鼠,，浸入75%乙醇浸泡5分鐘，轉移到通風柜中的解剖盤中,。

2. 打開皮膚,，暴露、收集股骨,，無菌狀態(tài)下移除附著的肌肉和組織,。

3. 并轉移股骨至預冷含雙抗的PBS中，洗滌三次,。冰上操作。

4. 切斷股骨骨骺,， 使用5mlPBS,，1ml注射器針頭沖洗，沖洗液由棕色變成粉紅色即可（股骨變白）,。沖洗后,，用1ml注射器吹打3-5次。

5. 70um濾網(wǎng)過濾,，棄去篩網(wǎng),。使用 15ml 離心管，先加入分離液,，然后緩慢加入濾過的懸液,。20℃環(huán)境下，600g 離心 25min,。

6. 離心后,，離心管中液體由上至下分為四層,。第一層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層,。第三層為透明分離液層,。第四層為紅細胞層。

7. 小心吸取離心管中的,，環(huán)狀乳白色單個核細胞層,，轉移到新離心管中，加入 5-10ml 洗滌液,，混勻細胞,。400g，離心 10min,。

8. 棄去上清,，用吸管吸取 5ml 清洗液重懸所得細胞。 250g,，離心 10min,，棄去上清。 再用M199培養(yǎng)基（含10 ng/mL VEGF,，1 ng/mL b-FGF,，1 ng/mL EGF，20%胎牛血清,、1%雙抗）清洗一次,，棄去上清，M199培養(yǎng)基重懸細胞,。250g,，離心 10min，棄去上清,。M199培養(yǎng)基重懸細胞,，計數(shù)。

9. 按3×10⁶/孔種入纖連蛋白包被過的24孔板,，每3天換一次培養(yǎng)基,，以去除非貼壁細胞，持續(xù)誘導培養(yǎng)2-3周,。