生物制品是指以微生物、寄生蟲,、動(dòng)物毒素,、生物組織作為起始材料，采用生物學(xué)工藝或分離純化技術(shù)制備,，并以生物學(xué)技術(shù)和分析技術(shù)控制中間產(chǎn)物和成品質(zhì)量制成的生物活性制劑,，包括菌苗、疫苗,、毒素,、類毒素、免疫血清,、血液制品,、免疫球蛋白、抗原,、細(xì)胞因子,、激素、酶,、發(fā)酵產(chǎn)品,、單克隆抗體、DNA重組產(chǎn)品,、體外免疫診斷制品等,。由于其特殊的性質(zhì)，生物制品的質(zhì)量控制至關(guān)重要,，國(guó)家規(guī)定應(yīng)當(dāng)對(duì)生物制品的生產(chǎn)過(guò)程和中間產(chǎn)品的檢驗(yàn)進(jìn)行特殊控制,，為響應(yīng)這一要求，一系列生物制品生產(chǎn)研發(fā)過(guò)程中相關(guān)雜質(zhì)的檢測(cè)試劑盒誕生,，大致可分為兩大類,，一類是檢測(cè)細(xì)胞來(lái)源的污染物,，例如來(lái)自包裝細(xì)胞系或細(xì)菌的宿主細(xì)胞蛋白和DNA，另一類則是檢測(cè)生產(chǎn)中使用的輔助病毒,、質(zhì)粒DNA,、牛血清、核酸酶,、蛋白酶,、抗生素等物質(zhì)。

細(xì)胞來(lái)源污染物檢測(cè)

1,、宿主細(xì)胞DNA/DNA片段殘留檢測(cè)

生物制品中的重組蛋白藥,、抗體藥、疫苗等產(chǎn)品是用連續(xù)傳代的動(dòng)物細(xì)胞株表達(dá)生產(chǎn),，雖然經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的純化工藝,，但產(chǎn)品中仍有可能殘余宿主細(xì)胞DNA，不同宿主細(xì)胞殘留的DNA帶來(lái)的潛在威脅并不相同,，盡管它們有著相同的基本結(jié)構(gòu)單位,，但其片段長(zhǎng)度不同，以不同的物理形式存在,，進(jìn)入人體后可造成多種多樣的后果,，如致癌性、感染性等,。因此從安全角度，在生物制品的生產(chǎn)工藝對(duì)殘留DNA進(jìn)行檢驗(yàn)驗(yàn)證是有必要的,。

《中國(guó)藥典》,、《美國(guó)藥典》和《歐洲藥典》均提及用qPCR法對(duì)DNA殘留量進(jìn)行測(cè)定。TaqMan®熒光探針是一種寡核苷酸探針,，其5’末端攜帶熒光基團(tuán)（報(bào)告基團(tuán)）,，如 FAM、TET,、VIC等,，3’端攜帶淬滅基團(tuán)，如 TAMRA,、BHQ1等,。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一條特異性的熒光探針，探針完整時(shí),，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收,。PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,，使熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（熒光定量PCR儀）可接收到熒光信號(hào),，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成,，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成同步,。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn),，在目前生物制藥細(xì)胞核酸殘留檢測(cè)中被廣泛使用,。

表 《中國(guó)藥典》2020版部分疫苗生物制品殘留DNA標(biāo)準(zhǔn)

2、宿主蛋白（HCP）殘留檢測(cè)

宿主蛋白即由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白,，包括目的蛋白和宿主細(xì)胞本身的蛋白,，它的存在可能誘發(fā)不良免疫反應(yīng)，也可能導(dǎo)致藥效發(fā)生變化,，因此需要對(duì)原料藥和下游純化過(guò)程（DSP）中間體中的HCP進(jìn)行表征和量化,。多國(guó)藥典規(guī)定酶聯(lián)免疫法（ELISA）作為HCP定量方式，《中國(guó)藥典》2020版明確規(guī)定CHO細(xì)胞殘余蛋白占總蛋白含量要保持在0.05%以下,。

圖 Absin CHO HCP ELISA Kit（abs590005）快速操作流程

工藝雜質(zhì)殘留檢測(cè)

1,、培養(yǎng)添加劑殘留檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)是生物制品生產(chǎn)過(guò)程中經(jīng)常用到的手段，牛血清更是被廣泛使用,，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必須的營(yíng)養(yǎng)成分,，BSA則是在牛血清中大量存在，然而BSA作為外源性蛋白如果跟隨藥物產(chǎn)品進(jìn)入人體,，將引發(fā)嚴(yán)重的免疫反應(yīng)并有可能影響藥物效果,，因此《中國(guó)藥典》2020版對(duì)各種疫苗BSA的殘留量都進(jìn)行了明確的規(guī)定，基本是不高于50ng/mL或者不高于50ng/劑,，并且藥典也推薦了酶聯(lián)免疫吸附法用于BSA的含量測(cè)定,。

除了牛血清外，各類抗生素亦是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的添加劑,，如卡那霉素,、慶大霉素等，ICH（人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)）將生物制品中的殘留抗生素列為工藝相關(guān)雜質(zhì),，要求“通過(guò)研究證明其在工藝中可有效控制或去除,，并達(dá)到可接受的水平”，《中國(guó)藥典》2020版明確規(guī)定對(duì)疫苗等預(yù)防類產(chǎn)品采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定抗生素殘留,，應(yīng)<50ng/劑,。

2、Protein A殘留檢測(cè)

Protein A有著與某些免疫球蛋白（特別是IgG）的Fc部分的高親和力,，因此Protein A親和層析柱被廣泛應(yīng)用于抗體類藥物的分離純化,，但是在使用過(guò)程中，由于待純化物中存在蛋白水解酶，會(huì)水解Protein A,，導(dǎo)致部分Protein A脫落并與抗體結(jié)合殘留在洗脫液中,，Protein A具有免疫原性，若進(jìn)入體內(nèi)可能引起不良免疫反應(yīng),，因此對(duì)于殘留量需要做質(zhì)控,。

3、膠原酶I型殘留檢測(cè)

膠原酶廣泛用于將組織消化成單細(xì)胞,，消化得到的單細(xì)胞被用于進(jìn)一步生產(chǎn)生物制品,，生物制品生產(chǎn)相關(guān)法規(guī)中明確了細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)材料檢測(cè)的必要性，故膠原酶的殘留量檢測(cè)也愈發(fā)引起重視,。

4,、內(nèi)毒素檢測(cè)

內(nèi)毒素是一種脂多糖，來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁,，會(huì)在細(xì)菌死亡或自溶后被釋放,，當(dāng)內(nèi)毒素進(jìn)入生物體，可能引起發(fā)熱反應(yīng),，因此也是影響生物制品安全性的重要因素之一,，《中國(guó)藥典》2020版規(guī)定用鱟試劑進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)。

鱟試劑是一種從動(dòng)物鱟的血液中提取的生物試劑,，能夠和內(nèi)毒素發(fā)生反應(yīng),，產(chǎn)生凝集沉淀，再應(yīng)用凝膠法或光度測(cè)定法檢測(cè)生物制品中內(nèi)毒素的含量,，為了符合可持續(xù)發(fā)展的原則,，科學(xué)家們研發(fā)出了重組鱟試劑，以替代傳統(tǒng)鱟血提取物,，從操作流程與分析方法上做到了無(wú)感替代,。

圖 鱟與鱟試劑檢測(cè)原理

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2020:1088.

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