環(huán)狀(circRNA)是一類特殊的共價閉環(huán)RNA分子,，在調(diào)控生理和病理進(jìn)程中,，通過不同的機理發(fā)揮著重要作用,。傳統(tǒng)上,，circRNA被認(rèn)為是一種非編碼RNA(ncRNA),。2014年，在北卡羅來納大學(xué)報導(dǎo)了環(huán)形RNA在細(xì)胞內(nèi)可通過非帽依賴的機理來翻譯蛋白,，人們認(rèn)識到circRNA也具有編碼與表達(dá)蛋白的能力,。此后，隨著體外環(huán)化技術(shù)的發(fā)展,，比線性mRNA穩(wěn)定性更強的合成circRNA成為mRNA治療領(lǐng)域備受關(guān)注的新技術(shù),，有望以mRNA藥物相似的遞送方法，實現(xiàn)疾病的治療,。

圖1 環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)

一,、circRNA的特點

1、強穩(wěn)定性：與線性RNA相比,，circRNA的主要優(yōu)勢就是其環(huán)狀結(jié)構(gòu)提高了穩(wěn)定性,。因為circRNA中5’和3’末端的缺失使其具有外切酶抗性,，不能通過典型的RNA降解途徑降解，需要通過核酸內(nèi)切酶線性化后將其降解（圖2,，a-c）,，因此，具有更高的體內(nèi)穩(wěn)定性,，半衰期更長,。

圖2 circRNA的降解和翻譯

2、非帽依賴性翻譯：大多數(shù)真核生物mRNA的翻譯起始于5’端,，以典型的帽(7GpppN)依賴方式進(jìn)行（圖2,，d），由于步驟復(fù)雜且需要招募較多起始因子,，該過程具有高能量消耗的特點,，因此，當(dāng)機體處于病毒感染或疾病等細(xì)胞應(yīng)激的不利條件下,，該典型翻譯起始將被整體抑制,，以確保細(xì)胞響應(yīng)應(yīng)激并存活。那么當(dāng)?shù)湫头g機制下調(diào)時,，維持細(xì)胞生存所需要的關(guān)鍵蛋白的產(chǎn)生就需要另一套非典型翻譯機制,，即非帽依賴性翻譯—通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)來驅(qū)動，而這種非帽機制正適合無5’端的circRNA,，已知IRES是circRNA主要的翻譯方式,。換言之，在疾病治療過程中,，當(dāng)機體處于ER應(yīng)激,、遺傳毒性應(yīng)激、缺氧,、營養(yǎng)剝奪,、體溫過低、體溫過高或感染狀態(tài)下,，帽依賴性翻譯起始被抑制,，線性mRNA無法有效翻譯，基于mRNA的藥物療效降低,，而circRNA可憑借非帽依賴性翻譯的機制優(yōu)勢,，保證蛋白質(zhì)的正常翻譯，保證藥物療效,。

3,、多順反子表達(dá)：多順反子表達(dá)是指從單個mRNA分子中翻譯兩個或多個獨立的基因。對于多順反子線性mRNA,，5’cap比IRES的表達(dá)更高,，導(dǎo)致蛋白表達(dá)比例不均,。而對于circRNA，通過引入多個IRES-ORF,，有可能達(dá)到接近化學(xué)計量的多順反子表達(dá),，因為所有編碼的蛋白質(zhì)都具有相同的翻譯起始機制。雖然這一點尚未得到證實,，但circRNA的多順反子表達(dá)可能有益于多組分蛋白質(zhì)療法,，其中蛋白質(zhì)復(fù)合物組分的受控比例至關(guān)重要。

4,、免疫原性低：線性RNA通過病原體識別受體（如RIG-I,、TLR3、TLR7,、TLR8等）刺激先天免疫,，導(dǎo)致干擾素反應(yīng)，進(jìn)而對其翻譯及應(yīng)用造成了負(fù)面影響,；而純的circRNA并不存在RIG-I,、TLR3、 TLR7及TLR8的識別序列,，這種“免疫沉默(immunosilent)”可以使其更有效地表達(dá)蛋白質(zhì),，而沒有抑制性干擾素反應(yīng),。此外,，先天免疫系統(tǒng)激活減少限制了樹突狀細(xì)胞的活化和成熟，有助于防止對編碼的治療蛋白產(chǎn)生免疫力,。

二,、circRNA的應(yīng)用

1、蛋白質(zhì)替代療法

蛋白質(zhì)替代療法的目的是恢復(fù)那些缺失或有缺陷的蛋白質(zhì)功能,，通常是由基因突變導(dǎo)致,。采用mRNA治療內(nèi)源蛋白缺失已應(yīng)用于多種疾病

相對于mRNA，circRNA在蛋白替代療法的應(yīng)用中具有諸多優(yōu)勢,，如結(jié)構(gòu)具有更高的穩(wěn)定性,，蛋白質(zhì)表達(dá)時間更長；具有與線性RNA相似的蛋白表達(dá)峰值,，但下降率較低,。這些優(yōu)勢使得circRNA可以產(chǎn)生較高的蛋白質(zhì)累積并持續(xù)較長時間；減少給藥頻率,，且免疫原性較低,。

2、疫苗

mRNA疫苗具有高效,、研發(fā)周期短,、模塊化生產(chǎn),、低成本等優(yōu)勢，已是通用的疫苗種類,，尤其在應(yīng)對新冠等突發(fā)流行病,，其極快的研發(fā)制造能力，優(yōu)勢極為顯著,。同時,，在面對病毒變異方面，多價mRNA疫苗的易得性可及時提供針對多種病原體的保護(hù),，意義重大,。

另外，mRNA疫苗的自佐劑效應(yīng)也為疫苗保護(hù)性免疫的誘導(dǎo)提供了支持,。在機制上,，mRNA會引起與病毒免疫相關(guān)的Th1偏向免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)對T細(xì)胞擴(kuò)增和免疫記憶形成至關(guān)重要的I型干擾素反應(yīng),，對病毒預(yù)防極有幫助,。不過該機制同時也限制了mRNA的帽依賴性翻譯起始，影響表達(dá)效率,。那么circRNA所使用的非帽依賴性起始機制,，例如不受干擾素抑制的IRES，是一種有吸引力的替代方案,。在保持circRNA抗原表達(dá)穩(wěn)定的同時,，更有效地誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)，可能會進(jìn)一步增強疫苗的保護(hù)作用,。

疫苗接種的目標(biāo)是誘導(dǎo)強烈的適應(yīng)性免疫反應(yīng)和長期免疫記憶,。適應(yīng)性免疫記憶的誘導(dǎo)部分取決于抗原暴露的持續(xù)時間。因此,，RNA編碼抗原的長期表達(dá)可以更有效地引發(fā)具有持久免疫記憶的免疫反應(yīng) ,。與mRNA相比，circRNA固有的穩(wěn)定性延長了蛋白質(zhì)翻譯的時間,，增加了體內(nèi)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量,，長期表達(dá)抗原可以更有效地誘導(dǎo)具有持久免疫記憶的免疫反應(yīng)。

3,、癌癥免疫療法

癌癥免疫治療采用機體免疫的作用成分如細(xì)胞因子,、抗體和免疫細(xì)胞等進(jìn)行癌癥的治療?；赗NA的免疫治療可以通過將癌癥新抗原編碼為疫苗,、免疫刺激細(xì)胞因子、抗體和免疫細(xì)胞受體實現(xiàn),，具有靈活性及多功能性,。此外,，還可以通過非病毒載體以mRNA直接轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，在體原位生產(chǎn)CAR-T細(xì)胞,，避免了傳統(tǒng)CAR-T細(xì)胞制造的缺點,。

circRNA在癌癥免疫治療中有幾個優(yōu)勢：

1）與mRNA相同，circRNA既可應(yīng)用于腫瘤個性化治療,，也可同時編碼多種新抗原,，降低癌癥逃逸和復(fù)發(fā)風(fēng)險。對于精準(zhǔn)細(xì)胞治療,，可以通過改變編碼序列輕松定制嵌合抗原受體的circRNA編碼,，并定制以靶向不同類型的癌癥進(jìn)行精準(zhǔn)癌癥免疫治療；

2）circRNA的穩(wěn)定性強,，可以保證抗原蛋白的穩(wěn)定表達(dá),；circRNA癌癥疫苗可以延長抗原呈遞，獲得更強的免疫反應(yīng),；增加免疫刺激蛋白,，如細(xì)胞因子和小抗體片段的表達(dá)時間，可以更好地將免疫細(xì)胞招募到腫瘤部位,；

3）早期研究表明,，修飾mRNA的低免疫原性對腫瘤中的蛋白質(zhì)表達(dá)很重要，因此circRNA固有的較低免疫原性對于腫瘤內(nèi)免疫刺激蛋白表達(dá)更具優(yōu)勢,。未修飾的RNA激活先天免疫系統(tǒng)將降低抗體表達(dá),，阻止適應(yīng)性免疫細(xì)胞有效募集到腫瘤中；

4）由于IRES啟動的非帽依賴性翻譯既可適應(yīng)各種復(fù)雜的腫瘤環(huán)境,，也可抵抗癌細(xì)胞減緩蛋白翻譯并逃逸細(xì)胞因子或抗體免疫治療機制,，增加了不同癌癥治療的一致性,。

4,、基因編輯

在基因編輯方面，基于circRNA的穩(wěn)定性,，首先可應(yīng)用于小的RNA組分,，比如向?qū)NA(adRNA/gRNA)，因為在基因編輯系統(tǒng)中的向?qū)NA是最脆弱的,，很容易被核酸酶降解,；其次，circRNA也有望用于編碼基于蛋白質(zhì)的編輯器以進(jìn)行基因編輯,。與mRNA相比,，circRNA提供的穩(wěn)定性和穩(wěn)健表達(dá)可以使Cas9蛋白的持久性更長，增加的蛋白表達(dá)可能會顯著提高基因編輯效率,。

在ADARs介導(dǎo)的RNA編輯中,，2019年,，北京大學(xué)魏文勝課題組曾研發(fā)出了借助gRNA募集ADAR實現(xiàn)RNA精準(zhǔn)編輯的新策略^[1]：LEAPER™。LEAPER™通過在細(xì)胞中表達(dá)短工程化的ADAR募集RNA(ADAR-recruiting RNA,，arRNA)來完成ADAR的招募以及RNA編輯,，由于這種技術(shù)彼時尚不成熟，具有一定長度的arRNA可能引起鄰近的堿基的脫靶編輯,。2022年,，魏文勝課題組推出了LEAPER™的升級版本—— LEAPER™ 2.0，設(shè)計并運用了可招募ADAR的環(huán)形RNA(circular ARAR-recruiting RNA,，circ-arRNA)^[2],，通過AAV遞送，遺傳編碼的circ-arRNA可以在人的原代細(xì)胞和類器官中實現(xiàn)長時程的RNA編輯,，這種可避免核酸外切酶切割的環(huán)狀RNA進(jìn)一步提升了體外和體內(nèi)編輯的效率和精準(zhǔn)性,，基本清除了雙鏈RNA區(qū)域內(nèi)目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本上的脫靶。

5,、非編碼環(huán)狀RNA治療

circRNA在細(xì)胞內(nèi)具有內(nèi)源性非編碼功能,，如miRNA和RNA結(jié)合蛋白海綿功能。circRNA作為調(diào)控RNA,，具有作為miRNA和RNA結(jié)合蛋白的競爭性抑制劑從而進(jìn)行治療的潛力,。不過目前已有研究都處于體外實驗階段，尚未有體內(nèi)數(shù)據(jù),，不過受限于遞送問題,，體內(nèi)模型可能也難以實現(xiàn)。

circRNA是共價封閉的,、高度穩(wěn)定的RNA形式,，具有巨大的治療應(yīng)用潛力。與線性蛋白相比,，circRNA具有穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)表達(dá)增強的能力等優(yōu)點,，在疫苗開發(fā)、癌癥免疫治療,、蛋白質(zhì)替代治療和基因編輯方面有著廣闊的可應(yīng)用空間,。總之circRNA在基于RNA的藥物領(lǐng)域是一種有潛力的RNA形式,，有望更新個性化治療手段,。

[1]Yi, Z., Zhu, S., et al. (2019). Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs. Nature biotechnology, 37(9), 1059–1069. 

[2] Yi, Z., Qu, L., Tang, H. et al. Engineered circular ADAR-recruiting RNAs increase the efficiency and fidelity of RNA editing in vitro and in vivo. Nat Biotechnol 40, 946–955 (2022). 

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