9號培養(yǎng)基的檢測方法與應用！

一,、背景

9號培養(yǎng)基用于多粘菌素等抗生素效價測定的底層培養(yǎng)基,，成分(g/L)：胰酶消化酪蛋白胨17.0；大豆粉木瓜酶消化物3.0,；氯化鈉5.0,；磷酸氫二鉀2.5；葡萄糖2.5,；Agar/瓊脂20.0,；pH值7.2±0.1 25℃。

用法：稱取本品50.0g,，加熱溶解于1000ml蒸餾水中,，分裝，121℃高壓滅菌15分鐘,，備用,。

多粘菌素系由多粘芽胞桿菌（bacilluspolymyxa）產(chǎn)生的一組多肽類抗生素。多粘菌素和供藥用,。常用其硫酸鹽,，為白色結(jié)晶性粉末,，易溶于水，有引濕性,。在酸性溶液中穩(wěn)定,，其中性溶液在室溫放置一周不影響效價，堿性溶液不穩(wěn)定,。

多粘菌素抗菌譜及臨床應用與多粘菌素相似,，對革蘭陰性桿菌，如大腸桿菌,、綠膿桿菌、副大腸桿菌,、肺炎克雷白桿菌,、嗜酸桿菌、百日咳桿菌及痢疾桿菌等有抑制或殺菌作用,。臨床上主要用于敏感菌引起的感染及綠膿桿菌引起的泌尿系統(tǒng)感染,、以及眼、氣管,、腦膜炎,、敗血癥、燒傷感染以及皮膚粘膜感染等,。

多粘菌素對綠膿桿菌,、大腸桿菌、肺炎克雷白桿菌,，以及嗜血桿菌,、腸桿菌屬、沙門菌,、志賀菌,、百日咳桿菌、巴斯德菌和弧菌等革蘭陰性菌有抗菌作用,。變形桿菌,、奈瑟菌、沙雷菌,、普魯威登菌,、革蘭陽性菌和專性厭氧菌均對本類藥物不敏感。細菌對本品與多粘菌素之間有交叉耐藥性,，但對本類藥物與他類抗菌藥物間則沒有交叉耐藥性發(fā)現(xiàn),。

二、應用

用于多重耐藥鮑曼不動桿菌對多粘菌素的耐藥機制研究：

測臨床分離鮑曼不動桿菌中攜帶的β-內(nèi)酰胺酶基因及外排泵基因,體外誘導鮑曼不動桿菌對多粘菌素產(chǎn)生耐藥,以探討其對多粘菌素的耐藥機制,。

三,、方法

1,、連續(xù)收集臨床分離的63株非重復多重耐藥鮑曼不動桿菌,采用微量肉湯稀釋法測定亞胺培南、美羅培南,、頭孢他啶,、頭孢吡肟、左氧氟沙星,、環(huán)丙沙星,、阿米卡星、多粘菌素及頭孢哌酮舒巴坦的抑菌濃度（MICs）,。

2,、采用腸桿菌科基因間重復序列-聚合酶鏈反應（ERIC-PCR）獲得63株鮑曼不動桿菌的指紋圖譜并進行同源性分析。

3,、采用聚合酶鏈反應（PCR）檢測β-內(nèi)酰胺酶基因TEM,、AmpC、OXA-23,、KPC,、IMP、VIM,外排泵基因adeB,、adeG,、adeJ、adeR,、adeS,兩組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因pmrA,、pmr B。

4,、采用體外實驗對收集的菌株進行誘導耐藥,以獲得多粘菌素耐藥的鮑曼不動桿菌,。

5、采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測誘導耐藥菌株及原始敏感菌株的外排泵基因adeB,、adeJ,、adeG及兩組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因pmrA、pmr B的m RNA表達情況,分析其表達差異,。

6,、對負責脂質(zhì)A生物合成的基因lpxA/lpxC/lpxD及兩組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因pmr A、pmrB進行PCR擴增并將擴增產(chǎn)物測序,探討耐藥菌株是否發(fā)生特異性突變,。

7,、采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）對誘導耐藥的菌株及原始敏感菌株進行檢測,分析其蛋白質(zhì)差異。

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