NGS在病原微生物檢測中的應(yīng)用

背景相關(guān)

由病原微生物引起的感染性疾病是臨床面臨的常見的疾病之一,，并且隨著人群結(jié)構(gòu)變化,、環(huán)境污染以及藥物濫用等因素的影響,，病原體呈現(xiàn)多樣化和復(fù)雜化的趨勢,，逐步威脅人類健康,。 隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展,，NGS已逐步應(yīng)用于感染性疾病的診斷,、治療和監(jiān)測,，在病原微生物鑒定,、分型、耐藥突變檢測及新型病原體鑒定方面有其*的優(yōu)勢,。

病原微生物檢測現(xiàn)狀

快速準(zhǔn)確的診斷可以對病情進行監(jiān)控,，提供有效治療，控制疾病的蔓延,。目前常用的病原微生物分子檢測方法主要有：PCR技術(shù)（包括常規(guī)PCR以及qPCR）,，基因芯片技術(shù)，NGS測序技術(shù),。還有一些其他技術(shù)如質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）等,。

NGS在病原微生物檢測的中的應(yīng)用

1,、感染性疾病病原體的鑒定

傳統(tǒng)的檢測方法主要有涂片鏡檢，生化反應(yīng)和免疫學(xué)檢測等等,，但存在周期長,、過程復(fù)雜以及靈敏度低等特點。PCR技術(shù)的出現(xiàn)部分解決了上述的問題,，但是難以解決未知微生物檢測的難題,。而NGS檢測無需對病原體進行分離培養(yǎng)，也不依賴于已知的核酸序列設(shè)計引物等,，可直接對標(biāo)本進行測序鑒別,，大大縮減建庫時間，提高診斷效率,，尤其在未知病原微生物檢測方面有的優(yōu)勢,。

目前NGS在病原微生物鑒定方面主要有兩種形式：rRNA多樣性測序和全基因組測序,，前者偏向細(xì)菌、真菌的鑒定以及菌群分析,，后者獲取的信息更為全面,，一般偏重病毒鑒定。

2,、病原體耐藥及毒力特征檢測

在當(dāng)前的抗生素不規(guī)范使用以及宿主免疫等重重壓力下,，病原體勢必在毒性以及耐藥方面有進化。這種高毒性的以及高耐藥性的菌株往往是導(dǎo)致感染性疾病發(fā)病率,、死亡率居高不下的重要原因,。

臨床上耐藥性及毒性檢測方法主要是體外藥物敏感性試驗、耐藥菌表型檢測等方法,。這些方法操作繁瑣,，且較費時、費力,。NGS技術(shù)通量高,、快速，在一次測序反應(yīng)中即可獲得細(xì)菌整個基因組的耐藥,、毒力等相關(guān)基因信息,，有助于揭示病原體毒力及耐藥機制，對臨床治療及指導(dǎo)用藥均具有重要意義,。

3,、病原體分型及流行溯源

目前病原體分型方法主要有多位點序列分型、脈沖場凝膠電泳,、多位點串聯(lián)重復(fù)序列分析技術(shù)等,。這些技術(shù)可檢測病原體的型別，但分辨率較低,，對于相似或變異度*的病原體如病毒等則難以區(qū)別,。而 NGS則彌補了此項缺陷，通過檢測病原體全基因組序列,，獲得全部遺傳信息,，被認(rèn)為是分辨率zui高的病原體分型方法,。

近年來抗生素的不規(guī)范使用甚至濫用,，使細(xì)菌耐藥情況日益突出,，耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)的暴發(fā)時有發(fā)生。NGS技術(shù)在對耐藥菌等病原體進行分型的基礎(chǔ)上,，可以判斷同源性遠(yuǎn)近,，分辨不同的進化路線，成為追蹤病原體*的重要手段,。

4. 腸道微生物菌群宏基因組測序分析

宏基因組學(xué)（Metagenomics）：以微生物生態(tài)群落中所有微生物的基因組為研究對象,，通過直接從環(huán)境樣本中提取全部微生物的DNA或者RNA構(gòu)建宏基因組文庫，研究群落中物種組成和功能組成,、同一個群體內(nèi)不同微生物的相互作用,、微生物群落與宿主之間的相互作用，并進行不同表型的樣品比較分析,，來解釋生物學(xué)現(xiàn)象,。

圖來源于Fields，Science. 2001,291,5507:1221-1224

近年來腸道微生物相關(guān)研究愈趨火熱,，不少研究表明,，腸道菌群與宿主共生共進化，在營養(yǎng)代謝等方面影響人體健康,，腸道微生態(tài)失衡與人體諸多疾病存在密切關(guān)系,。腸道微生物中關(guān)鍵功能菌更是有可能成為疾病診治的新型生物標(biāo)志物和治療靶點。2015年《科學(xué)》雜志還發(fā)文呼吁發(fā)起“聯(lián)合微生物組計劃”,。而NGS測序有望憑借其數(shù)據(jù)通量高,、成本低、速度快的特點,，成為研究腸道微生物和宏基因組學(xué)的有力工具,。

NGS在應(yīng)用中面臨的主要挑戰(zhàn)

雖然NGS在病原微生物的檢測中有著明顯的優(yōu)勢，但是也依然面臨不少挑戰(zhàn)：

• 參考數(shù)據(jù)庫的完整性

微生物檢測鑒定的準(zhǔn)確性很大程度上取決于參考數(shù)據(jù)庫的范圍與完整性,；

• 臨床標(biāo)本的復(fù)雜性

臨床標(biāo)本來源復(fù)雜多樣,，可能存在病原體信息太少而導(dǎo)致數(shù)據(jù)丟失或病原體數(shù)據(jù)混雜在正常菌群中難以區(qū)分;

• NGS測序技術(shù)的局限性

目前的分析質(zhì)量依賴于測序質(zhì)量、基因組組裝的質(zhì)量以及參考基因組序列的選擇和質(zhì)量；

• 質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化

參考基因組的選擇,，分型方法如何選擇等,，目前尚未建立不同標(biāo)本測序前處理和參數(shù)設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

文末小結(jié)：

NGS技術(shù)被認(rèn)為是一種應(yīng)用前景的實驗技術(shù),，盡管依然路途艱辛,，但隨著測序成本的降低以及測序技術(shù)的進步，相比較于其他的檢測方法,，NGS在病原微生物檢測行業(yè)的優(yōu)勢逐漸凸顯,，必將成為臨床診斷的有力工具。目前國內(nèi)的基因檢測市場空間巨大,，臨床醫(yī)師也越來越認(rèn)識到這項技術(shù)的價值,，加上目前初始階段的從業(yè)者們在參考數(shù)據(jù)庫構(gòu)建等方面的持續(xù)耕耘，病原微生物基因檢測市場有更廣闊的空間亟待發(fā)掘,。

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主要特點：

• 實驗流程更精簡：片段化/末修/加A一步完成,，大大縮減建庫時間,；
• 樣本適用范圍廣：適用于痰液，腹水,，腦脊液,，F(xiàn)FPE等各類樣本；
• 適用場景更廣泛：自動化建庫平臺首xuan,；
• 酶切可控時間長：僅需調(diào)整酶切時間即可得到目標(biāo)片段,；
• 耐抑制物能力強：對于復(fù)雜樣本中的一些抑制物有更好的耐受能力。

微生物實戰(zhàn)案例：

客戶單位：數(shù)據(jù)來源于上海某生物公司D*

實驗樣本：痰液,，腹水

實驗結(jié)論：不同模板的質(zhì)量不均一,，采用不同的酶切時間可獲得文庫。

產(chǎn)品信息：

參考文獻：

1.分子技術(shù)在感染性疾病病原體溯源和監(jiān)測中的應(yīng)用與展望, 中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志. 2018,，41（1）：1-4

2.新一代測序技術(shù)在臨床微生物檢測中的應(yīng)用, 診斷學(xué)理論與實踐. 2018,，2：127-131

3.宏基因組測序在感染性疾病病原體檢測中的應(yīng)用, 傳染病信息. 2018，1（31）：15-18

4.感染性疾病病原學(xué)診斷新技術(shù)與臨床應(yīng)用策略, 協(xié)和醫(yī)學(xué)雜志. 2018,，9（5）：399-403