NGS在病原微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

背景相關(guān)

由病原微生物引起的感染性疾病是臨床面臨的常見的疾病之一,，并且隨著人群結(jié)構(gòu)變化,、環(huán)境污染以及藥物濫用等因素的影響,，病原體呈現(xiàn)多樣化和復(fù)雜化的趨勢(shì),，逐步威脅人類健康,。 隨著測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，NGS已逐步應(yīng)用于感染性疾病的診斷,、治療和監(jiān)測(cè),，在病原微生物鑒定、分型,、耐藥突變檢測(cè)及新型病原體鑒定方面有其*的優(yōu)勢(shì),。

病原微生物檢測(cè)現(xiàn)狀

快速準(zhǔn)確的診斷可以對(duì)病情進(jìn)行監(jiān)控，提供有效治療,，控制疾病的蔓延,。目前常用的病原微生物分子檢測(cè)方法主要有：PCR技術(shù)（包括常規(guī)PCR以及qPCR），基因芯片技術(shù),，NGS測(cè)序技術(shù),。還有一些其他技術(shù)如質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）等。

NGS在病原微生物檢測(cè)的中的應(yīng)用

1,、感染性疾病病原體的鑒定

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要有涂片鏡檢,，生化反應(yīng)和免疫學(xué)檢測(cè)等等,，但存在周期長、過程復(fù)雜以及靈敏度低等特點(diǎn),。PCR技術(shù)的出現(xiàn)部分解決了上述的問題,，但是難以解決未知微生物檢測(cè)的難題。而NGS檢測(cè)無需對(duì)病原體進(jìn)行分離培養(yǎng),，也不依賴于已知的核酸序列設(shè)計(jì)引物等,，可直接對(duì)標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序鑒別，大大縮減建庫時(shí)間,，提高診斷效率,，尤其在未知病原微生物檢測(cè)方面有的優(yōu)勢(shì)。

目前NGS在病原微生物鑒定方面主要有兩種形式：rRNA多樣性測(cè)序和全基因組測(cè)序,，前者偏向細(xì)菌,、真菌的鑒定以及菌群分析，后者獲取的信息更為全面,，一般偏重病毒鑒定,。

2、病原體耐藥及毒力特征檢測(cè)

在當(dāng)前的抗生素不規(guī)范使用以及宿主免疫等重重壓力下,，病原體勢(shì)必在毒性以及耐藥方面有進(jìn)化,。這種高毒性的以及高耐藥性的菌株往往是導(dǎo)致感染性疾病發(fā)病率、死亡率居高不下的重要原因,。

臨床上耐藥性及毒性檢測(cè)方法主要是體外藥物敏感性試驗(yàn),、耐藥菌表型檢測(cè)等方法。這些方法操作繁瑣,，且較費(fèi)時(shí),、費(fèi)力。NGS技術(shù)通量高,、快速,，在一次測(cè)序反應(yīng)中即可獲得細(xì)菌整個(gè)基因組的耐藥、毒力等相關(guān)基因信息,，有助于揭示病原體毒力及耐藥機(jī)制,，對(duì)臨床治療及指導(dǎo)用藥均具有重要意義。

3、病原體分型及流行溯源

目前病原體分型方法主要有多位點(diǎn)序列分型,、脈沖場(chǎng)凝膠電泳,、多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列分析技術(shù)等。這些技術(shù)可檢測(cè)病原體的型別,，但分辨率較低,，對(duì)于相似或變異度*的病原體如病毒等則難以區(qū)別。而 NGS則彌補(bǔ)了此項(xiàng)缺陷,，通過檢測(cè)病原體全基因組序列,，獲得全部遺傳信息，被認(rèn)為是分辨率zui高的病原體分型方法,。

近年來抗生素的不規(guī)范使用甚至濫用,，使細(xì)菌耐藥情況日益突出，耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)的暴發(fā)時(shí)有發(fā)生,。NGS技術(shù)在對(duì)耐藥菌等病原體進(jìn)行分型的基礎(chǔ)上,，可以判斷同源性遠(yuǎn)近，分辨不同的進(jìn)化路線,，成為追蹤病原體*的重要手段,。

4. 腸道微生物菌群宏基因組測(cè)序分析

宏基因組學(xué)（Metagenomics）：以微生物生態(tài)群落中所有微生物的基因組為研究對(duì)象，通過直接從環(huán)境樣本中提取全部微生物的DNA或者RNA構(gòu)建宏基因組文庫,，研究群落中物種組成和功能組成、同一個(gè)群體內(nèi)不同微生物的相互作用,、微生物群落與宿主之間的相互作用,，并進(jìn)行不同表型的樣品比較分析，來解釋生物學(xué)現(xiàn)象,。

圖來源于Fields,，Science. 2001,291,5507:1221-1224

近年來腸道微生物相關(guān)研究愈趨火熱,，不少研究表明，腸道菌群與宿主共生共進(jìn)化,，在營養(yǎng)代謝等方面影響人體健康,，腸道微生態(tài)失衡與人體諸多疾病存在密切關(guān)系。腸道微生物中關(guān)鍵功能菌更是有可能成為疾病診治的新型生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),。2015年《科學(xué)》雜志還發(fā)文呼吁發(fā)起“聯(lián)合微生物組計(jì)劃”,。而NGS測(cè)序有望憑借其數(shù)據(jù)通量高、成本低,、速度快的特點(diǎn),，成為研究腸道微生物和宏基因組學(xué)的有力工具。

NGS在應(yīng)用中面臨的主要挑戰(zhàn)

雖然NGS在病原微生物的檢測(cè)中有著明顯的優(yōu)勢(shì),，但是也依然面臨不少挑戰(zhàn)：

• 參考數(shù)據(jù)庫的完整性

微生物檢測(cè)鑒定的準(zhǔn)確性很大程度上取決于參考數(shù)據(jù)庫的范圍與完整性,；

• 臨床標(biāo)本的復(fù)雜性

臨床標(biāo)本來源復(fù)雜多樣，可能存在病原體信息太少而導(dǎo)致數(shù)據(jù)丟失或病原體數(shù)據(jù)混雜在正常菌群中難以區(qū)分;

• NGS測(cè)序技術(shù)的局限性

目前的分析質(zhì)量依賴于測(cè)序質(zhì)量,、基因組組裝的質(zhì)量以及參考基因組序列的選擇和質(zhì)量,；

• 質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化

參考基因組的選擇，分型方法如何選擇等,，目前尚未建立不同標(biāo)本測(cè)序前處理和參數(shù)設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),。

文末小結(jié)：

NGS技術(shù)被認(rèn)為是一種應(yīng)用前景的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，盡管依然路途艱辛,，但隨著測(cè)序成本的降低以及測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步,，相比較于其他的檢測(cè)方法，NGS在病原微生物檢測(cè)行業(yè)的優(yōu)勢(shì)逐漸凸顯,，必將成為臨床診斷的有力工具,。目前國內(nèi)的基因檢測(cè)市場(chǎng)空間巨大，臨床醫(yī)師也越來越認(rèn)識(shí)到這項(xiàng)技術(shù)的價(jià)值,，加上目前初始階段的從業(yè)者們?cè)趨⒖紨?shù)據(jù)庫構(gòu)建等方面的持續(xù)耕耘,，病原微生物基因檢測(cè)市場(chǎng)有更廣闊的空間亟待發(fā)掘。

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OnePot系列DNA建庫試劑盒是針對(duì)illumina平臺(tái)定向研發(fā)的酶切法建庫試劑盒,，擺脫了繁瑣的超聲流程,，采用酶切法建庫。精簡(jiǎn)實(shí)驗(yàn)流程,，建庫更快,，成本更低，且兼容自動(dòng)化建庫平臺(tái),，是病原微生物檢測(cè)的“助手”,。

主要特點(diǎn)：

• 實(shí)驗(yàn)流程更精簡(jiǎn)：片段化/末修/加A一步完成，大大縮減建庫時(shí)間；
• 樣本適用范圍廣：適用于痰液,，腹水,，腦脊液，F(xiàn)FPE等各類樣本,；
• 適用場(chǎng)景更廣泛：自動(dòng)化建庫平臺(tái)首xuan,；
• 酶切可控時(shí)間長：僅需調(diào)整酶切時(shí)間即可得到目標(biāo)片段；
• 耐抑制物能力強(qiáng)：對(duì)于復(fù)雜樣本中的一些抑制物有更好的耐受能力,。

微生物實(shí)戰(zhàn)案例：

客戶單位：數(shù)據(jù)來源于上海某生物公司D*

實(shí)驗(yàn)樣本：痰液,，腹水

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：不同模板的質(zhì)量不均一，采用不同的酶切時(shí)間可獲得文庫,。

產(chǎn)品信息：

參考文獻(xiàn)：

1.分子技術(shù)在感染性疾病病原體溯源和監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用與展望, 中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志. 2018,，41（1）：1-4

2.新一代測(cè)序技術(shù)在臨床微生物檢測(cè)中的應(yīng)用, 診斷學(xué)理論與實(shí)踐. 2018，2：127-131

3.宏基因組測(cè)序在感染性疾病病原體檢測(cè)中的應(yīng)用, 傳染病信息. 2018,，1（31）：15-18

4.感染性疾病病原學(xué)診斷新技術(shù)與臨床應(yīng)用策略, 協(xié)和醫(yī)學(xué)雜志. 2018,，9（5）：399-403