本篇文章由專業(yè)生化試劑供應(yīng)商上海嵐興生物為您提供.

一,、勻漿介質(zhì)

一般采用0.05 mol/L Tris-HCl, pH 7.4 磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶可根據(jù)樣本及測(cè)定指標(biāo)的情況自行設(shè)定濃度,目的是保持樣本的等滲環(huán)境,。

二,、細(xì)胞樣本的前處理:

1,、細(xì)胞沉淀的收集：

① 懸浮細(xì)胞: 對(duì)于懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,，直接通過離心收集細(xì)胞沉淀,，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘,，棄上清留細(xì)胞沉淀,。

② 貼壁細(xì)胞: 對(duì)于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞,，用胰酶將細(xì)胞消化下來，或用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下來,，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘,，棄上清留細(xì)胞沉淀。

我們一般建議客戶,，細(xì)胞密度不要小于一百萬個(gè)/ml,。

2、細(xì)胞沉淀的洗滌：

在細(xì)胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS （等滲）,， 輕輕顛倒混勻,，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘，棄上清留細(xì)胞沉淀,。

重復(fù)上述操作反復(fù)洗滌1～2次,。

3,、勻漿的方式：手工勻漿，超聲破碎,裂解液裂解,反復(fù)凍融,。

① 手工勻漿：在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測(cè)指標(biāo)的不同而有所改變,，一般加入0.5ml，細(xì)胞密度不小于一百萬個(gè)/ml）,，混勻,，將細(xì)胞懸浮于PBS中，用移液器將細(xì)胞懸浮液移至玻璃勻漿管中（2ml玻璃勻漿管）,，將玻璃勻漿管置于冰水混合物中,，手動(dòng)勻漿3分鐘，然后取破碎好的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行測(cè)定,。

② 超聲破碎:

在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測(cè)指標(biāo)的不同而有所改變,，一般加入0.5ml，細(xì)胞密度不小于一百萬個(gè)/ml）,，混勻,，將細(xì)胞懸浮于PBS中，在冰水浴條件下進(jìn)行如下操作:

     a,、用超聲粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細(xì)胞破碎，也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀,，用400安培,，5秒/次，間隙10秒反復(fù)3～5次,。

      b,、用超聲細(xì)胞破碎儀，300W功率,，每次超聲3～5秒,，間隔30秒，重復(fù)4～5次,。

③ 裂解液裂解 

常用裂解液有SDS,、NP-40、TritonX-100,這三種去垢劑的作用是不同的,，或者說作用力量強(qiáng)弱不同,。

1、SDS屬于離子型去垢劑,，zui厲害,，基本可以把細(xì)胞*破掉，DNA會(huì)釋放出來,，裂解液變得很粘稠,。

2,、NP-40是很溫和的去垢劑，1%濃度的基本可以破壞掉胞膜,，而對(duì)核膜破壞的作用弱,，結(jié)合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。

3,、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間,，偏向于NP40，也是常用的細(xì)胞裂解液成分之一,，在保護(hù)蛋白活性方面有一定作用（SDS基本會(huì)使蛋白變性失活）,。

去垢劑屬性只是一方面，buffer,、配比,、濃度,、提取方法和材料處理也都是關(guān)鍵因素

由于很多裂解液都是蛋白變性劑,對(duì)酶活力的測(cè)定有一定的影響,一般不推薦用裂解液進(jìn)行裂解,。

④ 反復(fù)凍融:

在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測(cè)指標(biāo)的不同而有所改變，一般加入0.5ml,，細(xì)胞密度不小于一百萬個(gè)/ml）,，混勻，將細(xì)胞懸浮于PBS中,，放低溫冰箱中結(jié)冰,，溶解，再結(jié)冰,，再溶解,，反復(fù)3次左右）。

                由于反復(fù)凍融對(duì)酶活力影響較大,一般不推薦使用