本產(chǎn)品僅供科研,，不得做其它用途

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本產(chǎn)品就是根據(jù)PCR原理專門開發(fā)的試劑盒,，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板,。

2. 提供陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品。

3. 產(chǎn)品精心優(yōu)化且特異性高,，引物是根據(jù)高度保守區(qū)設(shè)計,，不會跟除此之外的其它微生物DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

4. PCR mix中含上樣染料,，PCR后可以直接上樣電泳,。

5. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的PCR反應(yīng)。

6. 本產(chǎn)品只能用于定性實驗,，不能用于定量,。

7. 本產(chǎn)品只能用于科研

王不留行探針法PCR鑒定試劑盒樣品的制備　

【試劑盒組成】

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融,，有效期12個月,。

定義和原理

PCR 探針法試劑盒是基于聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù),，結(jié)合探針來檢測特定核酸序列的工具包。其原理是在常規(guī) PCR 基礎(chǔ)上,，加入了一段能與目標核酸序列特異性結(jié)合的熒光標記探針,。在 PCR 擴增過程中，當探針與目標序列結(jié)合后,，通過熒光信號的變化來實時監(jiān)測 PCR 產(chǎn)物的擴增情況,。

主要組成成分

探針：帶有熒光基團和淬滅基團，在完整狀態(tài)下,，淬滅基團抑制熒光基團的熒光信號,。當探針與目標序列結(jié)合并被核酸酶切割后，熒光基團和淬滅基團分離,，從而產(chǎn)生熒光信號,。

DNA 聚合酶：負責在引物的引導(dǎo)下，將脫氧核苷酸（dNTPs）逐個添加到引物的 3' 端,，合成新的 DNA 鏈,。

dNTPs：即脫氧核苷三磷酸，包括 dATP,、dTTP,、dCTP 和 dGTP，是合成 DNA 的原料,。

反應(yīng)緩沖液：為 PCR 反應(yīng)提供適宜的 pH 值,、離子強度等環(huán)境條件，保證 DNA 聚合酶的活性和反應(yīng)的順利進行,。

常見類型

TaqMan 探針法試劑盒：TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針,，其 5' 端標記熒光報告基團，3' 端標記淬滅基團,。在 PCR 擴增過程中,，Taq DNA 聚合酶的 5'-3' 外切酶活性會將與目標序列結(jié)合的探針切割，使熒光報告基團和淬滅基團分離,，熒光信號增強,。通過檢測熒光信號的強度，可以實時監(jiān)測 PCR 產(chǎn)物的擴增情況,。

分子信標探針法試劑盒：分子信標是一種具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針,，其兩端分別標記熒光報告基團和淬滅基團。在沒有目標序列存在時,，分子信標呈發(fā)夾結(jié)構(gòu),，熒光報告基團和淬滅基團靠近，熒光信號被淬滅。當存在目標序列時,，分子信標與目標序列雜交,，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，熒光報告基團和淬滅基團分離,，產(chǎn)生熒光信號,。

2. 樣品制備

DNA提取：使用適合的DNA提取試劑he提取待測樣品中的DNA,，確保DNA的純度和完整性,。

樣品處理：樣品需在0-4℃條件下處理，避免RNA降解,，并在實驗后立即檢測或儲存于-20℃,。

3. 反應(yīng)體系構(gòu)建

反應(yīng)管標記：根據(jù)實驗需求，標記N+9或N+4個PCR管,，其中N為樣品數(shù)量,，+9或+4分別用于標準曲線、陰性對照和陽性對照,。

加入試劑：

每孔加入25μL反應(yīng)體系,，包括模板DNA、引物,、探針,、dNTPs、Taq酶等,。

陽性對照和陰性對照分別加入不同濃度的標準品或無DNA的溶液,。

4. PCR擴增

初始變性：95℃預(yù)變性3分鐘。

循環(huán)擴增：

溫度設(shè)置：95℃（變性）15秒,，60℃（退火）30秒,，72℃（延伸）1分鐘。

循環(huán)次數(shù)：通常為40次,，每次循環(huán)后收集熒光信號,。

熒光信號檢測：在60℃退火階段收集FAM通道的熒光信號,，實時監(jiān)控擴增過程,。

5. 數(shù)據(jù)分析

定量分析：

繪制標準曲線：以陽性對照濃度的log值為橫軸，Ct值為縱軸,，計算待測樣品的DNA濃度,。

根據(jù)待測樣品的Ct值推算其濃度。

定性分析：

陰性對照無Ct值或Ct值≥40,，陽性對照有典型擴增曲線且Ct值<40,，待測樣品根據(jù)Ct值判斷陽性或陰性。

6. 結(jié)果驗證

必要時進行驗證實驗：如凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物大小，確保實驗結(jié)果的可靠性,。

注意事項

實驗環(huán)境：實驗應(yīng)在超凈工作臺或生物安全柜內(nèi)進行,，避免污染。

個人防護：佩戴一次性手套,、口罩和無塵工作服,，避免直接接觸試劑。

試劑保存：所有試劑需避光保存,，避免反復(fù)凍融,。

廢棄物處理：實驗后廢棄物需無害化處理

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