為什么提取出的總RNA會降解?為什么OD260/280不在1.8-2.0之間,？

為什么。,。,。小伙伴們如果有這些疑問的話，不防往下看看到底是為什么,。

1,、使用前防范：TRIzol劇毒且易揮發(fā)（由于主要成分是苯酚），lv仿呢也是一種有毒也易揮發(fā)的試劑,，有的小盆友為了防止氧化,，還會加入β巰基乙醇，這個反正建議有鼻子的童鞋都做好防護。提取RNA前做好保護措施,，在通風廚中操作,，所有接觸TRIzol的耗材，扔到專門的密封的桶中,，等待處理,。否則整個實驗室都會彌漫著氣味！

2,、*前奏：所有耗材（槍頭,、EP管）均經過RNA酶滅活或者直接購買無RNA酶的耗材，除RNA酶主要方法是用DEPC水浸泡48小時（DEPC雖然味道香,，但卻是強致癌的,，泡管子的時候別一直去聞它，一般來說煮沸或高溫高壓滅菌15min后,，DEPC就會降解成二氧化碳和水）,，操作前戴口罩。

3,、RNA非常容易降解,，所有步驟盡量在冰盒里面操作，包括離心時需用4度預冷的離心機,。

4,、1-5×10^7細胞或者50-100mg組織加入1ml TRIzol，細胞或者組織過多,，TRIzol過少會導致裂解不充分,，內源性RNA酶抑制不*，導致RNA降解,。

5,、TRIzol加入細胞后，反復吹打,，充分裂解細胞至均一透亮，不粘稠為止,。

6,、加入Lv仿后充分混勻，其實這步也不能過于劇烈,，上層的水相含有RNA,，中間的組織相含有DNA和蛋白質，剩余的一部分DNA會萃取到lv仿中,，同時lv仿具有使蛋白質變性的作用,，離心完，中間那層就是組織層。

7,、離心后,，溶液分層，上層為含有RNA的水相,，中間層乳白色的為含有部分DNA,、蛋白質的組織層，下層紅色的為含有DNA和部分蛋白質的lv仿, 此時,，注意,，“寧少勿多”，提取上層無色液體時,，小心輕柔,，可以用200ul的槍抽吸，特別注意：一般1ml的TRIzol時zui多可以提取500μl上清,，但是建議提取400ul以下,，千萬避免吸到中間的乳白色組織層，否則zui后測量RNA時,，OD260/280非常低,，會有蛋白混入。

8,、異丙醇加入的目的是為了使RNA沉淀,，此時RNA已經提出來了，應輕輕混勻,，避免RNA損傷,。離心后肉眼可見EP管底部白色羽毛狀沉淀即為RNA沉淀。


9,、75%乙醇加入的目的是為了洗滌和沉淀作用,，也應該輕柔。

10,、zui后乙醇應盡量充分揮干,，先用槍頭盡量把75%乙醇吸干，再晾5min,，否則沒有晾干乙醇,，加入DEPC水時可能導致RNA白色沉淀不溶解。

11,、加入DEPC水溶解RNA時,，可根據自己需要的濃度來調整加入DEPC水的量。

12,、RNA提取后可以跑瓊脂糖膠來判斷降解情況,，純的無降解的RNA跑完瓊脂糖膠后應該有3條帶，26S，18S,， 5S,。其中5S很淡，不容易看見,。如果條帶很淡,，且有拖尾現(xiàn)象，提示有RNA降解,。