產(chǎn)品簡介

JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit）是一種以JC-1為熒光探針，快速且靈敏的檢測細(xì)胞,、組織或純化線粒體膜電位變化的試劑盒,。因線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。因此本試劑盒可用于早期的細(xì)胞凋亡檢測,。

JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm 位的理想熒光探針,。JC-1染料以電勢依賴性的方式積聚在線粒體內(nèi)，可以用來檢測細(xì)胞,、組織或純化的線粒體膜電位,。正常線粒體內(nèi)，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光（Ex=585 nm, Em=590 nm）,；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失,，JC-1 只能以單體的形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光（Ex=514 nm, Em=529 nm）,。JC-1 不僅可用于定性檢測,，因顏色的變化可以非常直接的反映出線粒體膜電位的變化。也可以用于定量檢測,，因線粒體的去極化程度可以通過紅/綠熒光強(qiáng)度的比例來衡量,。

產(chǎn)品組成

保存及運(yùn)輸：-20℃避光干燥保存,，至少1年有效,。運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸

使用方法 JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒

1. JC-1 染色工作液制備

對于六孔板，本試劑盒可檢測100個(gè)樣品,。每孔所需JC-1染色工作液的量為1ml,，其他培養(yǎng)器皿的 JC-1染色工作液的用量以此類推；對于細(xì)胞懸液每 50～100萬細(xì)胞需 0.5mL JC-1 染色工作液,。 取適量 JC-1（200×）,，按照每50μL JC-1（200×）加入 8mL 超純水的比例稀釋 JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻 JC-1,。然后再加入 2mL JC-1 染色緩沖液（5×）,，混勻后即為 JC-1 染色工作液。

【注意】：必須先把 JC-1（200×）用超純水（試劑盒提供）充分溶解混勻后,，才可加入 JC-1 染色緩沖液（5×）,。不可先配制 JC-1 染色緩沖液（1×）再加入 JC-1（200×），這樣 JC-1 會(huì)很難充分溶解,，會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測,。

2. 陽性對照的設(shè)置

CCCP（10mM）推薦按 1∶1000 的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至 10μM,，處理細(xì)胞 20min,。隨后按照下述方法裝載 JC-1，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測,。 對于大多數(shù)細(xì)胞,，通常 10μM CCCP 處理 20 min 后線粒體的膜電位會(huì)wanquan喪失，JC-1 染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光,；而正常的細(xì)胞經(jīng) JC-1 染色后應(yīng)顯示紅色熒光,。對于特定的細(xì)胞，CCCP 的作用濃度和作用時(shí)間可能

有所不同,，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料決定,。

3. 對于懸浮細(xì)胞

1）取10～60 萬細(xì)胞,，重懸于 0.5mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅,。

2）加入0.5mL JC-1染色工作液,，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20min,。

3）孵育期間,，按照每 1mL JC-1 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1 染色緩沖液（1×）,，并放置于冰浴,。

4）37℃孵育結(jié)束后，600×g4℃離心 3～4min 沉淀細(xì)胞,。棄上清,，注意盡量不要吸除細(xì)胞。

5）用 JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌 2 次：加入 1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞,，600×g4℃離心 3～4min沉淀細(xì)胞,，棄上清。再加入 1mL JC-1 染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞,，600×g4℃離心 3～4min 沉淀細(xì)胞,，棄上清。

6）再用適量 JC-1 染色緩沖液（1×）重懸后,，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察,，也可以用熒光分光 光度計(jì)檢測或流式細(xì)胞儀分析。

4. 對于貼壁細(xì)胞

【注意】：對于貼壁細(xì)胞,，如果希望采用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測,，可以先收集細(xì)胞,，重懸后參考懸浮細(xì)胞的方法進(jìn)行檢測,。

1）對于六孔板的一個(gè)孔，吸除培養(yǎng)液,，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可用 PBS 或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次,，加入 1mL 細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅,。

2）加入 1mL JC-1 染色工作液,，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20min,。

3）孵育期間,，按照每 1mL JC-1 染色緩沖液（5×）加入 4mL 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1 染色緩沖液（1×）,，并放置于冰浴,。

4）37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用 JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌 2 次,。

5）加入 2mL 細(xì)胞培養(yǎng)液,，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

6）熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察,。

5. 對于純化的線粒體

1）將配制好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 染色緩沖液（1×）稀釋 5 倍,。

2）0.9mL 5 倍稀釋的 JC-1 染色工作液中加入 0.1mL 總蛋白量為 10～100μg 純化的線粒體。

3）用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描（time scan）,，激發(fā)波長為485nm,，發(fā)射波長為 590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀,，激發(fā)波長不能設(shè)置為 485nm 時(shí),，可在475～520nm范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。另外,，也可以參考下面步驟 6 中的波長設(shè)置進(jìn)行熒光檢測,。

4）用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟 6。

6. 熒光觀測和結(jié)果分析

檢測 JC-1 單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為 490nm,，發(fā)射光設(shè)置為 530nm,；檢測 JC-1 聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為 525nm,，發(fā)射光設(shè)置為 590nm,。

【注1】：此處測定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察,，檢測 JC-1 聚合物時(shí)可使用常來檢測碘化丙啶或者 Cy3 用的標(biāo)準(zhǔn)帶通濾波器,。檢測 JC-1 單體可使用常來檢測 FITC 或 GFP 的標(biāo)準(zhǔn)帶通濾波器。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降,，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期,。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常,。

注意事項(xiàng)

1）JC-1（200×）在4℃,、冰浴等較低溫度情況下會(huì)凝固而粘在離心管管底、管壁或管蓋內(nèi),，可以 20～25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用,。

2）裝載完 JC-1 后用 JC-1 染色緩沖液（1×）洗滌時(shí)，使 JC-1 染色緩沖液（1×）保持 4℃左右,，此時(shí)洗滌效果較好,。

3）JC-1 探針裝載完并洗滌后盡量在 30min 內(nèi)完成后續(xù)檢測。在檢測前需冰浴保存,。

4）請勿把JC-1染色緩沖液（5×）全部配制成JC-1染色緩沖液（1×）,，本試劑盒使用過程中需直接使用JC-1 染色緩沖液（5×）,。

5）如果發(fā)現(xiàn) JC-1 染色緩沖液（5×）中有沉淀，必須全部溶解后才能使用,，可在 37℃加熱促進(jìn)溶解,。

6）CCCP 為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有毒,，請注意小心防護(hù),。

7）為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。

相關(guān)產(chǎn)品

JC-1JC-1部分引用文獻(xiàn) JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒

(1) [IF=9.7]Contribution of ferroptosis and GPX4’s dual functions to osteoarthritis progression-EBioMedicine Published:January 27, 2022 DOI:https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.103847

此圖的原始數(shù)據(jù)出自文獻(xiàn)（1）中,。

(2) [IF=11.4]VDR regulates mitochondrial function as a protective mechanism against renal tubular cell injury in diabetic rats.  -Redox Biology -Volume 70, April 2024, 103062.V

此圖的原始數(shù)據(jù)出自文獻(xiàn)（2）中。

(3)[IF=11.1]LONP1 targets HMGCS2 to protect mitochondrial function and attenuate chronic kidney disease-EMBO Mol Med(2023)15: e16581 https://doi.org/10.15252/emmm.202216581

                                             免疫熒光共定位分析mPTC(上,，標(biāo)尺:20um)和人腎組織(下,，標(biāo)尺:200um)中LONP1、HMGCS2和線粒體,。

 此圖的原始數(shù)據(jù)出自文獻(xiàn)（3）中,。