關(guān)鍵詞:流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
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測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
PI 染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中,，離心,，1500rpm , 5min，棄上清液,。
2,、加入PBS 1ml離心洗滌1次，棄上清,。
3,、加入2ml預(yù)冷的70%酒精，4℃固定30min,，或是-20℃固定,。
4、離心,，棄上清液,。
5、用1×PBS 1ml洗滌1次,，離心,。
6、加入RNase A (工作濃度20ug/ml)于500ul 1×PBS中,，37℃孵育30min,，離心。
7,、用1×PBS 1ml洗滌1次,，離心。
8,、加入PI(工作濃度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中,，室溫避光孵育30min。
9,、混勻,，過(guò)300目篩網(wǎng)，置流式管中,， 4℃冰箱保存,，待測(cè)。
GFP PI染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中,，離心,，1500rpm , 5min，棄上清液,。
2,、加入PBS 1ml離心洗滌1次，棄上清,。
3,、加入2ml預(yù)冷PFA，PFA的濃度根據(jù)細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié),，4℃固定30min,。
以下步驟同PI 染色操作步驟的
細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟
1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中,，離心,，1500rpm，5min,，棄上清液,。
2、以冷PBA 1ml,，離心洗滌,，棄上清液。
3,、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul,。用微量移液器輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min-1h,。
4,、離心棄上清液。
5,、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,，以除去未結(jié)合的多余抗體成分。
6,、向細(xì)胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻,，置流式管中，4℃避光保存,，待測(cè),。
細(xì)胞表面間接免疫熒光染色操作步驟
1-2、同細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟
3,、 用PBA稀釋的*抗體200ul,，對(duì)照管加入對(duì)應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IgG,，輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育1.5-2h,。離心,，棄上清。
4,、 BS1ml離心洗滌1次,，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。
5,、 PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200ul。吹打混勻,，4℃或置冰上孵育30min,，避光。
6,、 PBS 1ml離心洗滌2次,。
7、將細(xì)胞重新懸浮于500ulPBS中,，混勻,，置流式管中，避光,，4℃冰箱保存,，待測(cè)。
胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟
1,、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中,，離心，1500rpm , 5min,，棄上清液,。
2、用1×PBS1ml洗滌1次,，離心。
3,、4%PFA 1ml,，4℃固定30min。
4,、用1×PBS1ml洗滌1次,，離心。
5,、0,、1% Triton-100 1ml, 室溫10min,。
6、用1×PBS1ml洗滌1次,，離心,。
7、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul,，用微量移液器輕輕吹打混勻,，4℃或置冰上孵育30min-1h。
8,、離心棄上清液,。
9、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,，以除去未結(jié)合的多余抗體成分,。
10、向細(xì)胞中加入冷PBS500ul,吹打混勻,，置流式管中,，4℃避光保存，待測(cè),。
胞內(nèi)間接免疫熒光染色操作步驟
1-6,、同胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟
7、加入用PBA稀釋的*抗體200ul,，對(duì)照管加入對(duì)應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IgG,，輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育1,、5-2h,。離心，棄上清,。
8,、冷PBS1ml離心洗滌1次，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體,。
9,、加入PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200ul。吹打混勻,，4℃或置冰上孵育30min,，避光。
10,、冷PBA1ml離心洗滌2次,。
11、將細(xì)胞重新懸浮于500ulPBS中,，混勻,，置流式管中,，避光，4℃冰箱保存,，待測(cè),。
備注：                                                
1、RNase A：貯液濃度：1mg/ml,；
工作液配制：加1 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,，使終濃度為 20ug/ml。
2,、PI：貯液濃度：2,、5mg/ml；       
工作液配制：加2,、5 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,，使終濃度為 50ug/ml。
3,、PBA：即PBS加1-2% 牛血清白蛋白，加0,、1%疊氮鈉,。
4、檢測(cè)樣品細(xì)胞濃度1x106 /ml,。