關(guān)鍵詞:流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
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產(chǎn)品品牌： http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html
測序?qū)嶒?yàn)流程：
PI 染色操作步驟
1,、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心,，1500rpm , 5min,，棄上清液。
2,、加入PBS 1ml離心洗滌1次,，棄上清。
3,、加入2ml預(yù)冷的70%酒精,，4℃固定30min，或是-20℃固定,。
4,、離心，棄上清液。
5,、用1×PBS 1ml洗滌1次,，離心。
6,、加入RNase A (工作濃度20ug/ml)于500ul 1×PBS中,，37℃孵育30min，離心,。
7,、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心,。
8,、加入PI(工作濃度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室溫避光孵育30min,。
9,、混勻，過300目篩網(wǎng),，置流式管中,， 4℃冰箱保存，待測,。
GFP PI染色操作步驟
1,、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心,，1500rpm , 5min,，棄上清液。
2,、加入PBS 1ml離心洗滌1次,，棄上清。
3,、加入2ml預(yù)冷PFA,，PFA的濃度根據(jù)細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)，4℃固定30min,。
以下步驟同PI 染色操作步驟的
細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟
1,、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心,，1500rpm,，5min,，棄上清液,。
2、以冷PBA 1ml,，離心洗滌,，棄上清液,。
3、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul,。用微量移液器輕輕吹打混勻,，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4,、離心棄上清液,。
5、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,，以除去未結(jié)合的多余抗體成分,。
6、向細(xì)胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻,，置流式管中,，4℃避光保存，待測,。
細(xì)胞表面間接免疫熒光染色操作步驟
1-2,、同細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟
3、 用PBA稀釋的*抗體200ul,，對照管加入對應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動物IgG,，輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育1.5-2h,。離心,，棄上清。
4,、 BS1ml離心洗滌1次,，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。
5,、 PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200ul,。吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min,，避光,。
6、 PBS 1ml離心洗滌2次,。
7,、將細(xì)胞重新懸浮于500ulPBS中，混勻,，置流式管中,，避光，4℃冰箱保存，待測,。
胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟
1,、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心,，1500rpm , 5min,，棄上清液。
2,、用1×PBS1ml洗滌1次,，離心。
3,、4%PFA 1ml,，4℃固定30min。
4,、用1×PBS1ml洗滌1次,，離心。
5,、0,、1% Triton-100 1ml, 室溫10min。
6,、用1×PBS1ml洗滌1次,，離心。
7,、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul,，用微量移液器輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min-1h,。
8,、離心棄上清液。
9,、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,，以除去未結(jié)合的多余抗體成分。
10,、向細(xì)胞中加入冷PBS500ul,吹打混勻,，置流式管中，4℃避光保存,，待測,。
胞內(nèi)間接免疫熒光染色操作步驟
1-6、同胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟
7,、加入用PBA稀釋的*抗體200ul,，對照管加入對應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動物IgG,，輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育1,、5-2h。離心,，棄上清,。
8、冷PBS1ml離心洗滌1次,，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體,。
9、加入PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200ul,。吹打混勻,，4℃或置冰上孵育30min，避光,。
10,、冷PBA1ml離心洗滌2次。
11,、將細(xì)胞重新懸浮于500ulPBS中,，混勻，置流式管中,，避光,，4℃冰箱保存，待測,。
備注：
1,、RNase A：貯液濃度：1mg/ml；
工作液配制：加1 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,，使終濃度為 20ug/ml,。
2、PI：貯液濃度：2,、5mg/ml,；
工作液配制：加2、5 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,，使終濃度為 50ug/ml,。
3、PBA：即PBS加1-2% 牛血清白蛋白,，加0,、1%疊氮鈉。
4,、檢測樣品細(xì)胞濃度1x106 /ml,。
